一種金龜子綠僵菌固體培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物發(fā)酵方法領(lǐng)域，涉及一種真菌的固體培養(yǎng)方法，特別是涉及一種金 龜子綠僵菌的固體培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 20世紀(jì)中期以來(lái)，由于化學(xué)殺蟲(chóng)劑無(wú)限制地使用，嚴(yán)重污染了環(huán)境和農(nóng)林牧產(chǎn)品， 危害了人畜健康，同時(shí)使自然生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞。生物防治日益被人們所重視，利用昆蟲(chóng)病 原微生物防治害蟲(chóng)是生物防治的重要手段之一。真菌殺蟲(chóng)劑由于具有良好的擴(kuò)散效果、較 長(zhǎng)的宿存能力、獨(dú)特的體壁入侵方式，以及對(duì)害蟲(chóng)不產(chǎn)生抗藥性和易大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，使得 真菌殺蟲(chóng)劑在森林害蟲(chóng)、土壤害蟲(chóng)和刺吸式口器害蟲(chóng)的生物防治中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。其中， 金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae)是世界性分布的殺蟲(chóng)真菌，能寄生8個(gè)目30個(gè) 科昆蟲(chóng)，利用金龜子綠僵菌防治害蟲(chóng)的研宄與實(shí)踐已逾百年，其具有致病力強(qiáng)、對(duì)人、畜、作 物無(wú)害、不殺傷天敵、不污染環(huán)境、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，是一種可持續(xù)防治害蟲(chóng)的優(yōu)良制劑，也 是當(dāng)今用于生物防治的主要菌劑之一，可替代化學(xué)藥劑的使用，在生物防治中具有重要的 應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 金龜子綠僵菌大量培養(yǎng)是滿(mǎn)足生產(chǎn)上應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外金龜子綠僵菌固體 培養(yǎng)一般采用單一的淺盤(pán)式、框架式或者塑料袋培養(yǎng)法，培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)濕度要求高，環(huán)境因 子調(diào)控困難，同時(shí)設(shè)備復(fù)雜、發(fā)酵周期長(zhǎng)，污染率高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率較低，這些 因素制約了綠僵菌的生產(chǎn)應(yīng)用和防治效果。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種發(fā)酵周期短、產(chǎn)量高且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的 金龜子綠僵菌固體培養(yǎng)方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種金龜子綠僵菌固體培養(yǎng) 方法，將金龜子綠僵菌液體菌種接種到固體培養(yǎng)基后裝入可堆疊的、底面具有通孔的發(fā)酵 箱中，進(jìn)行固體培養(yǎng)，包括兩個(gè)時(shí)期，菌絲生長(zhǎng)期（包含菌絲生長(zhǎng)延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和生 長(zhǎng)穩(wěn)定期）和產(chǎn)孢期（菌絲生長(zhǎng)衰退期）；
[0007] 所述的菌絲生長(zhǎng)期為：在18~22°C環(huán)境中，將盛有接種過(guò)金龜子綠僵菌的固體培 養(yǎng)基的發(fā)酵箱在空發(fā)酵箱上逐層堆疊4~8層，最上層的發(fā)酵箱蓋上蓋體，進(jìn)行密閉式發(fā)酵 3~4天，所述空發(fā)酵箱的底面不具有通孔；
[0008] 所述的產(chǎn)孢期為：菌絲生長(zhǎng)期后，打開(kāi)最上層的發(fā)酵箱的蓋體并將所有發(fā)酵箱隔 開(kāi)，或?qū)l(fā)酵箱錯(cuò)開(kāi)堆疊，在溫度為23~27°C、濕度為80 %的環(huán)境中進(jìn)行開(kāi)放式發(fā)酵3~ 4天。
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于：在固體培養(yǎng)前期堆疊 4~8個(gè)發(fā)酵箱進(jìn)行發(fā)酵（不包括 底部的空發(fā)酵箱），這可有效保證在菌絲生長(zhǎng)期所需求的高濕度，使菌絲迅速長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng) 基，同時(shí)極大降低培養(yǎng)過(guò)程中的污染幾率；固體培養(yǎng)后期分離、隔開(kāi)堆疊的發(fā)酵箱，采用開(kāi) 放式發(fā)酵，可有效改善培養(yǎng)基的通氣性能，促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生。同時(shí)，堆疊式發(fā)酵箱輕巧、 移動(dòng)方便、組裝快捷、不受場(chǎng)地限制、容易清洗，可根據(jù)實(shí)際需要增減發(fā)酵箱數(shù)量，易實(shí)現(xiàn)規(guī) ?；a(chǎn)。使用本發(fā)明的金龜子綠僵菌的發(fā)酵過(guò)程中基本不用調(diào)控環(huán)境濕度，發(fā)酵周期平 均< 8天，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)孢水平均多I X IOltl孢子/g發(fā)酵物。本發(fā)明的發(fā)酵質(zhì)量穩(wěn)定、污染 率低，且不需要復(fù)雜的設(shè)備，對(duì)發(fā)酵室環(huán)境濕度要求低，降低了金龜子綠僵菌的生產(chǎn)技術(shù)門(mén) 檻，可實(shí)現(xiàn)金龜子綠僵菌的規(guī)模化生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為實(shí)施例1發(fā)酵過(guò)程固體料溫度變化圖。
[0011] 圖2為實(shí)施例2發(fā)酵過(guò)程固體料溫度變化圖。
[0012] 圖3為實(shí)施例1~5的發(fā)酵箱的立體圖。
[0013] 圖4為實(shí)施例1~5的空發(fā)酵箱的立體圖。
[0014] 圖5為實(shí)施例1~5固體培養(yǎng)前期發(fā)酵箱堆疊狀態(tài)示意圖。
[0015] 圖6為實(shí)施例1~5固體培養(yǎng)后期發(fā)酵箱隔開(kāi)狀態(tài)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附 圖予以說(shuō)明。
[0017] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：固體培養(yǎng)前期采用4~8個(gè)發(fā)酵箱堆疊進(jìn)行密閉式發(fā) 酵，保證在菌絲生長(zhǎng)期所需求的高濕度，使菌絲迅速長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基，同時(shí)極大降低培養(yǎng)過(guò) 程中的污染幾率；固體培養(yǎng)后期采用開(kāi)放式發(fā)酵，可有效改善培養(yǎng)基的通氣性能，促進(jìn)分生 孢子的產(chǎn)生。
[0018] 請(qǐng)參照?qǐng)D3~6,本發(fā)明提供一種金龜子綠僵菌固體培養(yǎng)方法，該方法將金龜子綠 僵菌液體菌種接種到固體培養(yǎng)基后裝入底面具有通孔的、可堆疊的發(fā)酵箱中，進(jìn)行固體培 養(yǎng)，包括兩個(gè)時(shí)期，菌絲生長(zhǎng)期和產(chǎn)孢期；
[0019] 所述的菌絲生長(zhǎng)期為：在18~22°C環(huán)境中，將盛有接種過(guò)金龜子綠僵菌的固體培 養(yǎng)基的發(fā)酵箱在底層空發(fā)酵箱上逐層堆疊4~8層，最上層的發(fā)酵箱蓋上蓋體，進(jìn)行密閉式 發(fā)酵3~4天，所述空發(fā)酵箱的底面不具有通孔；
[0020] 所述的產(chǎn)孢期為：菌絲生長(zhǎng)期后，打開(kāi)最上層的發(fā)酵箱的蓋體并將所有發(fā)酵箱隔 開(kāi)，或?qū)l(fā)酵箱錯(cuò)開(kāi)堆疊，在溫度為23~27°C、濕度為80 %的環(huán)境中進(jìn)行開(kāi)放式發(fā)酵3~ 4天。
[0021] 從上述描述可知，本發(fā)明的有益效果在于：在固體培養(yǎng)的前3~4天（接種后第1 天為金龜子綠僵菌生長(zhǎng)的延滯期，第2天為金龜子綠僵菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第3~4天為 菌絲生長(zhǎng)穩(wěn)定期，此3個(gè)時(shí)期為金龜子綠僵菌菌絲生長(zhǎng)期），在此期間采用4~8個(gè)發(fā)酵箱 堆疊進(jìn)行發(fā)酵（不包括底部的空發(fā)酵箱），這可有效保證在菌絲生長(zhǎng)期所需求的高濕度，使 菌絲迅速長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基，同時(shí)極大降低了培養(yǎng)過(guò)程中的污染幾率；固體培養(yǎng)的后期（為 綠僵菌菌絲生長(zhǎng)的衰退期，也是綠僵菌的產(chǎn)孢期）分離、隔開(kāi)堆疊的發(fā)酵箱，采用開(kāi)放式發(fā) 酵，可有效改善培養(yǎng)基的通氣性能，促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生。同時(shí)，堆疊式發(fā)酵箱輕便、移動(dòng)方 便、不受場(chǎng)地限制、容易清洗，可根據(jù)實(shí)際需要增減發(fā)酵箱數(shù)量，易實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。本發(fā)明 固體培養(yǎng)工藝簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜設(shè)備，發(fā)酵期間基本不需要調(diào)控濕度，發(fā)酵周期短，產(chǎn)品質(zhì) 量穩(wěn)定，降低了金龜子綠僵菌的生產(chǎn)技術(shù)門(mén)檻。
[0022] 進(jìn)一步的，進(jìn)行固體培養(yǎng)前，先配制固體培養(yǎng)基，按體積份將麥麩3份、谷殼3份、 米粉1份和玉米粉1份混合后得到固體培養(yǎng)料，每500g固體培養(yǎng)料混合后加入400~500g 水得到所述固體培養(yǎng)基。
[0023] 由上述描述可知，固體培養(yǎng)基配方中農(nóng)副產(chǎn)品麥麩和谷殼占比大，并加入了米粉 和玉米粉等，配制簡(jiǎn)單，原料價(jià)廉、來(lái)源廣泛，降低了生產(chǎn)成本。
[0024] 進(jìn)一步的，固體培養(yǎng)基接種前，將固體培養(yǎng)基蒸汽高溫滅菌30~50min，冷卻后用 于金龜子綠僵菌的固體培養(yǎng)。所述發(fā)酵箱中的接種過(guò)金龜子綠僵菌的固體培養(yǎng)基的厚度為 3~5cm，所述發(fā)酵箱的內(nèi)部高度為15cm~25cm。所述的發(fā)酵箱采用PP材質(zhì)，所述通孔的 直徑為4~5謹(jǐn)。
[0025] 由上述描述可知，堆疊時(shí)按照逐個(gè)累疊的方式進(jìn)行，基層為空發(fā)酵箱（不打孔）， 頂部用塑料蓋蓋好，以保證固體培養(yǎng)基的水分不會(huì)散失，故此過(guò)程中對(duì)環(huán)境濕度無(wú)要求；保 持固體培養(yǎng)基的厚度為3~5cm，發(fā)酵箱內(nèi)部高度15cm-25cm，底部密布4~5_的通孔，培 養(yǎng)溫度設(shè)定為18~22°C。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)通孔過(guò)小的情況下影響發(fā)酵容器中的溫濕度分散 的均一性，將導(dǎo)致各箱層間的濕度相差大，發(fā)酵不均勻；而通孔過(guò)大后會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基質(zhì)漏到 下層的情況，不利于生產(chǎn)。箱體高度太低會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)所產(chǎn)生的熱量無(wú)法及時(shí)擴(kuò)散，出現(xiàn) "燒料"現(xiàn)象，不利于菌種繁殖；箱體過(guò)高，會(huì)造成空間浪費(fèi)，空間利用率下降，也會(huì)導(dǎo)致水蒸 氣和溫度擴(kuò)散范圍過(guò)廣達(dá)不到發(fā)酵的溫濕要求。選擇合適的范圍，既能保證菌絲生長(zhǎng)快速， 又能避免發(fā)酵產(chǎn)熱出現(xiàn)"燒料"現(xiàn)象。
[0026] 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】有：
[0027] 一種金龜子綠僵菌固體培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0028] 1液體菌種的培養(yǎng)
[0029] I. 1菌種：產(chǎn)孢良好的金龜子綠僵菌。一般以斜面低溫保存。
[0030] 1. 2斜面菌種：預(yù)先將金龜子綠僵菌菌種用試管斜面在25土 rc條件下傳代培養(yǎng)、 活化，當(dāng)斜面表面長(zhǎng)滿(mǎn)孢子時(shí)即可使用。斜面培養(yǎng)基為微生物培養(yǎng)中所通用的馬鈴薯葡萄 糖瓊脂（PDA)培養(yǎng)基。
[0031] 1. 3液體培養(yǎng)基：為通用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，每