五種二苯乙烯三聚體的制備方法及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物領域，尤其涉及五種二苯乙烯三聚體的制備方法及其作為制備 α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] α -葡萄糖苷酶抑制劑（AGHI)是二十世紀八十年代出現(xiàn)的一類新的抗糖尿病藥 物，它能通過抑制小腸上皮絨毛膜上的α-葡萄糖苷酶的作用來延緩碳水化合物的消化， 進而有效推遲糖尿病人餐后血糖升高的時間及進程，降低糖尿病風險。目前，以阿卡波糖， 伏格列波糖為代表的AGHI已成為治療II型糖尿病的一線藥物，也可作為治療I型糖尿病 的輔助藥物。然而，由于這些人工合成的AGHI具有的一些較為明顯的副作用（N. Engl. J. Med.，2007, 356, 1499-1501.)，如肝臟疾病，腸胃氣脹，腹部痙攣等，因此，人們在過去的 二十年中一直試圖從動植物和食品中去尋找毒副作用較小的天然AGHI。
[0003] 可以預見的是，隨著老齡化社會的到來，我國的糖尿病發(fā)病率越來越高，并且我國 以及東南亞地區(qū)飲食習慣以碳水化合物為主，因此，開發(fā)高效、低毒的AGHI具有巨大的經(jīng) 濟效益和社會效益。我國中藥資源豐富，許多藥材均已被長期的臨床實踐證明具有較好的 降糖作用，將這些具有確切降糖療效的中藥材進行深入系統(tǒng)的活性成分篩選研宄，開發(fā)出 新的高效、低毒的AGHI的可能性將會比傳統(tǒng)的"盲篩"要大得多。
[0004] 基于上述分析，我們對臨床常用的31種具有降糖作用的中藥材進行了體外α-葡 萄糖苷酶(AGH)抑制活性初篩，結(jié)果表明，槐米、甘草、僵蠶、香附子等藥材醇提物對AGH具 有很高的抑制活性，尤以香附子活性為最強，因此我們對香附子的AGHI進行了深入的研 宄。
[0005] 香附子為莎草科植物莎草（分/76?/7/5· roiWflofe L.)的干燥根莖，辛、微苦、微甘， 平；歸肝、脾、三焦經(jīng)；具有行氣解郁、調(diào)經(jīng)止痛的功效，為中醫(yī)臨床的常用中藥。藥理研宄 表明，香附子具有抗炎、降血糖、抗血小板、保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗過敏反應等作用。Raut NA等發(fā) 現(xiàn)（Fitoterapia，2006, 77, 585-588.)香附子水醇提取物能有效降低四氧嘧啶誘導的糖尿 病大鼠的血糖；Ardestani A 等發(fā)現(xiàn)（Int. J Biol. Macromol.，2007, 41，572-578.)不同濃 度的香附子水醇提取物（25-250 μ g/mL)能顯著抑制晚期糖基化終產(chǎn)物（AGES)的形成。由 此可見，香附子的確具備治療糖尿病的潛力。Tran HHT等（Pharm. Biol·，2014, 52, 74-77.) 采用常規(guī)系統(tǒng)分離方法，從香附子中分離出了三種二苯乙烯二聚體化合物（cassigarol E, scirpusin A、scirpusin B)，具有一定的 AGH 抑制活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種以體外α -葡萄糖苷酶抑制活性為導向、化學分離與 活性評價同步進行的二苯乙烯三聚體化合物的制備方法及其作為制備α-葡萄糖苷酶抑 制劑藥物的應用。
[0007] 為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供五種二苯乙烯三聚體化合物的制備方法， 包括如下步驟。
[0008] 步驟1、藥材超聲提?。簩⑾愀阶臃勰┯?0%甲醇冷浸后超聲提取，所得提取物用 水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部 位及正丁醇提取部位；將各提取部位分別制成不同濃度的DMSO溶液，進行體外AGH抑制活 性檢測，確定乙酸乙酯活性部位活性最強。
[0009] 步驟2、硅膠柱層析分離：所述乙酸乙酯提取部位采用硅膠常壓層析分離，分別用 不同比例的石油醚、二氯甲烷、甲醇混合溶劑梯度洗脫，所述二氯甲烷與甲醇的體積比分別 為9:1、7:3、5:5 ;然后分別收集各洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，得各提取部位；將各提取部 位分別制成不同濃度的DMSO溶液，進行體外AGH抑制活性檢測，確定二氯甲烷與甲醇的體 積比為7:3的提取部位活性最強。
[0010] 步驟3、大孔樹脂柱層析分離：將步驟2中所得活性最強部位用HPDlOl型大孔吸 附樹脂分離，分別用40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇梯度洗脫； 分別收集各洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，得各提取部位；將各提取部位分別制成不同濃度的 DMSO溶液，進行體外AGH抑制活性檢測，確定60%甲醇水溶液的提取部位活性最強。
[0011] 步驟4、凝膠柱層析分離：將步驟3中所得活性最強部位用S印hadex LH-20凝膠 純化分離，甲醇洗脫，流速控制為30mL/h，每0. 25個柱體積（即0. 25BV)收集一次，共收集洗 脫液4BV ;將各洗脫液進行體外AGH抑制活性檢測，確定2. 25-3. 25 BV洗脫部位活性最強。
[0012] 步驟5、反相制備HPLC分離：將步驟4中所得活性最強洗脫部位采用反相制備型 高效液相色譜進行純化，40%甲醇-60%水溶液等度洗脫，分別收集保留時間為8. I min、 10. 6 min、11.9 min、17. 7 min和19. 6 min的流份，冷凍干燥后分別得到純度大于95%的五 種二苯乙烯三聚體化合物。
[0013] 所述保留時間為8. Imin的流份冷凍干燥后得到（±)-(E)_cyperusphenol A，即 化合物1 ;所述保留時間為10. 6 min的流份冷凍干燥后得到cyperusphenol B，即化合物2 ; 所述保留時間為11. 9 min的流份冷凍干燥后得到cyperusphenol D，即化合物3 ;所述保留 時間為17. 7 min的流份冷凍干燥后得到（E)-mesocyperusphenol A，即化合物4;所述保留 時間為19. 6min的流份冷凍干燥后得到cyperusphenol C，即化合物5。
[0014] 所述五種二苯乙烯三聚體化合物（即化合物1-5)的結(jié)構(gòu)式分別依次如下所示。
[0015] 本發(fā)明還提供五種二苯乙烯三聚體化合物作為制備α -葡萄糖苷酶抑制劑藥物 的應用，可用于防治II型糖尿病。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。
[0017] 本發(fā)明提供的五種二苯乙烯三聚體的制備方法，以對硝基酚- a -D-吡喃葡萄糖 苷為底物的酶-抑制藥的體外篩選模型為活性指導，經(jīng)硅膠、大孔樹脂、凝膠的初步柱分離 后，以制備型高效液相色譜為主要分離手段，通過一步高效液相制備，可同時直接獲得純度 大于95%的五種二苯乙烯三聚體。并且，以體外AGH抑制活性為導向，首次將體外AGH抑 制活性檢測與香附子有效成分分離相結(jié)合，避免了香附子的常規(guī)系統(tǒng)分離法中存在的工作 量大、周期長、過程繁瑣等不足，具有目標明確、經(jīng)濟環(huán)保等優(yōu)點。該制備方法能有效減少 分離工作的盲目性，省去了一些不必要的分離制備過程，實現(xiàn)了化學分離與活性評價的同 步進行。除此之外，以制備型高效液相色譜同時制備五種二苯乙烯三聚體具有分離制備工 藝簡單、分離過程快速省時、制備產(chǎn)品純度高、原料充分利用的特點。另外，本發(fā)明首次公 開了五種二苯乙烯三聚體化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以及其作為制備α-葡 萄糖苷酶抑制劑藥物的應用。該二苯乙烯三聚體化合物AGH抑制活性比二苯乙烯二聚體 (Scirpusins A、Scirpusins Β)強約5-10倍，比陽性對照藥(阿卡波糖）強1000倍，是一類 AGH強效抑制劑。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
[0019] 本實施例提供的五種二苯乙烯三聚體化合物（即化合物1-5)的制備方法，包括如 下步驟。
[0020] 步驟1、藥材超聲提?。簩⑾愀阶铀幉?購于大連市陽光大藥房）粉碎，取粉末 240g，用2500mL的80%甲醇冷浸24h后超聲提取3次，每次lh，合并三次提取液，減壓回收 得到提取物總浸膏25. 5g。然后用300mL的水分散，再依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正 丁醇各萃取3次，分別合并各萃取液，減壓濃縮回收溶劑，分別得到石油醚提取部位、乙酸 乙酯提取部位、正丁醇提取部位。將石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位 分別制成3. Omg/mL與0. 3mg/mL的DMSO溶液，各取20 μ L進行體外AGH抑制活性檢測，得 到活性最強的乙酸乙酯活性部位5. 4g。
[0021] 步驟2、硅膠柱層析分離：取乙酸乙酯活性部位浸膏5g，少量乙酸乙酯溶解，濕法 上樣，硅膠常壓層析（40X2. 5cm)分離，柱體積120mL;分別用3倍柱體積（BV)的石油醚、 二氯甲烷、甲醇混合溶劑梯度洗脫，所述二氯甲烷與甲醇的體積比分別為9:1、7:3、5:5,然 后分別收集各洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，得各提取部位；將各部位分別制成300 μ g/mL與 30 μ g/mL的DMSO溶液，各取20 μ L進行體外AGH抑制活性檢測，得到活性最強的二氯甲烷 與甲醇的體積比為7:3的部位0. 7g。
[0022] 步驟3、大孔樹脂柱層析分離：將步驟2中所得活性最強部位用4mL 40%甲醇溶 解，15000rpm離心，取上清液0. 44g，HPDlOl型大孔吸附樹脂柱（40 X 2. 5cm)分離，柱體積 30mL ;分別用5BV的40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、80%甲醇水溶液、100%甲醇梯度洗脫， 分別收集各洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，得各提取部位；將各提取部位分別制成300 μ g/mL 與30 μ g/mL的DMSO溶液，各取20 μ L進行體外AGH抑制活性跟蹤檢測，得到活性最強的 60%甲醇水溶液的部位0. 21g。
[0023] 步驟4、凝膠柱層析分離：將步驟3中所得活性最強部位用3mL甲醇溶解，Sephadex LH-20凝膠柱（80 X Icm)純化分離，柱體積60mL，洗脫溶劑為純甲醇，流速控制為30mL/h，每 0. 25個柱體積（即0. 25BV)收集一次，共收集洗脫液4BV ;將各管洗脫液各取20 μ L，直接進 行體外AGH抑制活性檢測，得到活性最強的2. 25-3. 25 BV洗脫部位0. 12g。
[0024] 步驟5、反相制備HPLC分離：將步驟4中所得活性最強洗脫部位采用反相制備 型高效液相色譜進行純化，色譜柱：Chromatorex C