0-24小時；
[0141] (4)將步驟（3) LB平板上長出的菌用冰上預冷的ImL Sistrom培養(yǎng)基洗脫至EP管 中。4°C 5000rpm下離心2分鐘，棄上清液，用500 μ 1冰上預冷的Sistrom培養(yǎng)基洗絳沉淀 兩次，最后用100 μ L冰上預冷的Sistrom培養(yǎng)基重懸沉淀，得到菌體懸浮液；
[0142] (5)將步驟（4)的菌體懸浮液涂布在Sistrom平板（Sistrom平板為向Sistrom培 養(yǎng)基中加入K 2TeO3和卡那霉素得到的K2TeO3濃度為150mg/L、卡那霉素濃度為50mg/L的固 體培養(yǎng)基）上，30°C下培養(yǎng)3-5天長出接合子，即為含有pBBRlMCS-2-Tsl的重組類球紅細 菌，將該重組菌命名為R. s (pBBRlMCS-2)。
[0143] 按照上述步驟（1) - (5)的方法，分別將重組大腸桿菌S17-1 (pBBRlMCS-2)替 換為 S17-1 (pBBRlMCS-2-Tsl)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts2)、S17-1 (pBBRlMCS-2-Ts3) 和S17-l(pBBRlMCS-2-Ts4)，替他步驟均不變，得到分別含有pBBRlMCS-2-Tsl、 pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 的重組類球紅細菌，將這些重組 菌分別命名為 R. s (pBBRlMCS-2-Tsl)、R. s (pBBRlMCS-2-Ts2)、R. s (pBBRlMCS-2-Ts3)和 R.s (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0144] 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在類球 紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1中的溫度敏感性
[0145] 將步驟1的R. s (pBBRlMCS-2-Tsl)接種至LB+kan液體培養(yǎng)基中，于30°C培養(yǎng)20 小時，將得到的菌液進行以下處理：
[0146] ①將菌液按I :500的比例接種至3mL LB液體培養(yǎng)基中，然后于30°C下培養(yǎng)24小 時，得到LB-30°C菌液；將LB-30°C菌液稀釋后得到LB-30°C稀釋菌液，將LB-30°C稀釋菌 液分別涂布至LB平板和LB+kan平板上，每個平板100 μ L LB-30°C稀釋菌液，然后于30°C 下培養(yǎng)4天，分別得到LB-LB-30°C平板和LB-LB+kan-30°C平板，統(tǒng)計LB-LB-30°C平板和 LB-LB+kan-30°C平板上的菌落數(shù)，計算得到重組載體pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液體培養(yǎng) 基中的丟失率，載體的丟失率=(LB-LB-30°C平板上的菌落數(shù)一 LB-LB+kan-30°C平板上的 菌落數(shù)）+LB-LB-30°C平板上的菌落數(shù)；
[0147] ②將菌液按I :500的比例接種至3mL LB+kan液體培養(yǎng)基中，然后于30°C下 培養(yǎng)24小時，得到LB+kan-30 °C菌液；將LB+kan-30 °C菌液稀釋后得到LB+kan-30 °C 稀釋菌液，將LB+kan-30 °C稀釋菌液分別涂布至LB平板和LB+kan平板上，每個平板 100 μ L LB+kan-30 °C稀釋菌液，然后于30 °C下培養(yǎng)4天，分別得到LB+kan-LB-30 °C平板 和 LB+kan_LB+kan_30 °C 平板，統(tǒng)計 LB+kan_LB_30 °C 平板和 LB+kan_LB+kan_30 °C 平板上 的菌落數(shù)，計算得到重組載體pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB+kan液體培養(yǎng)基中的丟失率， 載體的丟失率=(LB+kan-LB-30°C平板上的菌落數(shù)一 LB+kan-LB+kan-30°C平板上的菌落 數(shù)）+ LB+kan-LB-30°C平板上的菌落數(shù)；
[0148] ③將菌液按I :500的比例接種至3mL LB液體培養(yǎng)基中，然后于37°C下培養(yǎng)24小 時，得到LB-37°C菌液；將LB-37°C菌液稀釋后得到LB-37°C稀釋菌液，將LB-37°C稀釋菌 液分別涂布至LB平板和LB+kan平板上，每個平板100 μ L LB-37°C稀釋菌液，然后于37°C 下培養(yǎng)4天，分別得到LB-LB-37°C平板和LB-LB+kan-37°C平板，統(tǒng)計LB-LB-37°C平板和 LB-LB+kan-37°C平板上的菌落數(shù)，計算得到重組載體pBBRlMCS-2-Tsl在37°C LB液體培養(yǎng) 基中的丟失率（表6)，載體的丟失率=(LB-LB-37°C平板上的菌落數(shù)一 LB-LB+kan-37°C平 板上的菌落數(shù)）+LB-LB-37°C平板上的菌落數(shù)。
[0149] 按照上述方法，將 R. s(pBBRlMCS-2-Tsl)替換為 R. s(pBBRlMCS-2-Ts2)、 R. s(pBBRlMCS-2-Ts3)、R. s(pBBRlMCS-2-Ts4)和 R. s(pBBRlMCS-2)，其他步驟均不變，分 別得到宿主菌為類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1時重組載體pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 分別在 30°C LB 液 體培養(yǎng)基、30 °C LB+kan液體培養(yǎng)基和37 °C LB液體培養(yǎng)基中的丟失率（表6)。
[0150] 表6、溫度敏感型載體在類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中的丟失 率
[0151]
[0152]
[0153]在宿主菌為類球紅細菌 Rhodobacter sphaeroides 2· 4· 1 時，pBBRlMCS-2、 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在 30 °C LB 液 體培養(yǎng)基和30 °C LB+kan液體培養(yǎng)基中的丟失率以及pBBRlMCS-2在37 °C LB液體培養(yǎng) 基中的丟失率均在 13% 以下，pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4在37°C LB液體培養(yǎng)基中的丟失率分別達到78. 18%、81. 36%、80. 53%和 78. 57%，說明 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 在類 球紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1中均可表現(xiàn)出其一定的溫度敏感性。
【主權(quán)項】
1. 構(gòu)建重組載體的方法，是將SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為 目的基因表達盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載 體； 所述目的基因表達盒編碼的蛋白質(zhì)為將SEQIDNo. 2所示的蛋白質(zhì)進行Al)的改造、 保持SEQIDNo. 2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質(zhì)：所述Al)為如下All)和/或 A12)和 / 或A13): All)將SEQIDNo. 2 第 12 位的Ala突變?yōu)門hr; A12)將SEQIDNo. 2 第 81 位的Asp突變?yōu)镠is; A13)將SEQIDNo. 2 第 140 位的His突變?yōu)長eu。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的基因表達盒中的目的基因為將 SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進行BI)的改造、保持SEQIDNo. 1 的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子：所述BI) 為如下B11)和/或B12)和/或B13)和/或B14): BI1)將SEQIDNo. 1第1827位的G突變?yōu)锳; B12)將SEQIDNo. 1第2034位的G突變?yōu)镃; B13)將SEQIDNo. 1第2212位的A突變?yōu)門; B14)將SEQIDNo. 1第2249位的C突變?yōu)锳。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的基因表達盒中啟動所述目 的基因表達的啟動子為SEQIDNo. 1的第1557-1793位所示的DNA分子；所述目的基因表 達盒中終止所述目的基因表達的終止子為SEQIDNo. 1的第2457-2526位所示的DNA分子。4. 構(gòu)建重組載體的方法，是將SEQIDNo. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為 目的基因表達盒，并保持SEQIDNo. 1的其他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載 體； 所述目的基因表達盒編碼的蛋白質(zhì)為將SEQIDNo. 2所示的蛋白質(zhì)進行權(quán)利要求1所 述Al)及下述A2)、A3)和A4)這三種中至少一種的改造、保持SEQIDNo. 2的其它氨基酸 殘基均不變得到的蛋白質(zhì)： A2)將SEQIDNo. 2 第 130 位的His突變?yōu)镚ln; A3)將SEQIDNo. 2第86位的Arg突變?yōu)镃ys; A4)如下A41)和 / 或A42): A41)將SEQIDNo. 2 第 25 位的Lys突變?yōu)镚lu; A42)將SEQIDNo. 2 第 146 位的Ile突變?yōu)閂al。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述目的基因表達盒中的目的基因為將 SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進行權(quán)利要求2所述BI)及下述 B2)、B3)和B4)這三種中至少一種的改造、保持SEQIDNo. 1的第1794-2456位核苷酸所 示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子： B2)將SEQIDNo. 1第2183位的C突變?yōu)镚; B3)將SEQIDNo. 1第2049位的C突變?yōu)門; B4)如下B41)和/或M2): B41)將SEQIDNo. 1第1866位的A突變?yōu)镚; B42)將SEQIDNo. 1第2229位的A突變?yōu)镚。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述目的基因表達盒中啟動所述目 的基因表達的啟動子為將SEQIDNo. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進行如下C2)、 C3)和C4)這三種中至少一種的改造、保持SEQIDNo. 1的第1557-1793位核苷酸所示的 DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子： C2)如下C21)和 / 或C22): C21)將SEQIDNo. 1第1732位的A突變?yōu)镚; C22)將SEQIDNo. 1第1780位的G突變?yōu)門; C3)如下C31)和 / 或C32): C31)將SEQIDNo. 1第1747位的C突變?yōu)門; C32)將SEQIDNo. 1第1776位的T突變?yōu)锳; C4)將SEQIDNo. 1第1751位的T突變?yōu)锳; 所述目的基因表達盒中終止所述目的基因表達的終止子為SEQIDNo. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。7. 由權(quán)利要求1-6中任一所述方法構(gòu)建的重組載體。8. 含有權(quán)利要求7所述重組載體的重組微生物或重組細胞系。9. 下述任一產(chǎn)品： Pl、權(quán)利要求1或4所述蛋白質(zhì)； P2、權(quán)利要求2或5所述目的基因。10. 下述任一應(yīng)用： Ll、權(quán)利要求2或5所述目的基因在制備溫度敏感載體中的應(yīng)用； L2、權(quán)利要求7所述重組載體在作為溫度敏感載體中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts1及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的溫度敏感型載體，是將SEQ ID No.1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為目的基因表達盒，并保持SEQ ID No.1的其他核苷酸不變，得到的重組載體；目的基因表達盒編碼的蛋白質(zhì)為將SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)進行A1)的改造得到的蛋白質(zhì)：A1)為如下A11)、A12)和A13)：A11)將SEQ ID No.2第12位的Ala突變?yōu)門hr；A12)將SEQ ID No.2第81位的Asp突變?yōu)镠is；A13)將SEQ ID No.2第140位的His突變?yōu)長eu。
【IPC分類】C12N15/63, C12N1/15, C12N1/13, C12N1/19, C12N1/21
【公開號】CN104894153
【申請?zhí)枴緾N201510340926
【發(fā)明人】黃建忠, 江賢章, 周芬, 劉洪嬌, 祁峰, 張明亮, 陶勇
【申請人】福建師范大學, 中國科學院微生物研究所
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年6月18日