一條與石房蛤毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一條經(jīng)突變和截短優(yōu)化獲得的與石房蛤毒素 特異性結(jié)合的高親和力適配體，為樣品中痕量STX的分離富集，石房蛤毒素的快速檢測(cè)，中 和石房蛤毒素鈉離子通道抑制作用的藥物的制備，以及水體中毒素的去除奠定了基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] 石房蛤毒素（Saxitoxin，STX)屬于麻痹性貝類毒素家族，為胍胺類神經(jīng)性毒素， 是目前已知的最強(qiáng)有力的小分子神經(jīng)毒素之一。它來源于多種淡水藍(lán)細(xì)菌和海洋甲藻，通 過食物鏈蓄積于貝類、蟹類等水產(chǎn)品中，主要通過阻斷可興奮細(xì)胞表面的鈉離子通道，使細(xì) 胞膜失去極化狀態(tài)，從而阻斷神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)，導(dǎo)致人類和海洋動(dòng)物產(chǎn)生麻痹性貝類中毒。 小鼠腹腔注射、靜脈注射以及口服的半數(shù)致死量LD 5tl分別是S-IOyg kg'3.4yg kg<和 260 yg kg'世界各地都有包括STX在內(nèi)的麻痹性貝類毒素分布，尤其是歐洲及北美一些 國家。我國東南沿海一帶地區(qū)也經(jīng)常發(fā)生食用有毒蛤類、螺類、貝類引發(fā)的人中毒事件。為 了保證人類的健康不受威脅，對(duì)石房蛤毒素進(jìn)行監(jiān)測(cè)顯得尤為重要。聯(lián)合國衛(wèi)生組織和聯(lián) 合國糧農(nóng)組織規(guī)定及推薦的標(biāo)準(zhǔn)是80 μ gSTXeq/lOOg，即每一百克貝類軟組織中PSP毒性 的STX當(dāng)量不得高于80 μ g。
[0003] 人類多因誤食含STX的貝類等海產(chǎn)品而發(fā)生中毒，中毒癥狀往往因食入的量不同 而不同。輕度中毒表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉，局部皮膚有麻或刺痛感。重度中毒后，表現(xiàn)為神 經(jīng)肌肉麻痹，隨意肌無力，呼吸肌收縮無力，血壓下降，心率減慢，心律失常，患者多感到身 體有漂浮感，嚴(yán)重中毒15min內(nèi)就可死亡，STX中毒的死亡率約為10%左右。對(duì)STX中毒目 前沒有特效藥，臨床上主要是采取催吐、洗胃，用活性炭吸附胃內(nèi)的毒素。4-氨基吡啶可以 拮抗STX的毒性作用，起到治療效果，但4-氨基吡啶毒副作用大，安全劑量范圍小。
[0004] 鑒于STX的高危害性和分布的廣泛性，世界各國均將其列為水產(chǎn)品安全檢 驗(yàn)的必檢項(xiàng)目。長期以來一直用于STX檢測(cè)的方法是國際上公認(rèn)的小鼠生物學(xué)分析 (Jellett, J. F. , Stewartm, J. E. , Laycock, Μ. V. Toxicological evaluation of saxitoxin, neosaxitoxin, gonyautoxin II, gonyautoxin II plus III and decarba-moylsaxitoxin with the mouse neuroblastoma cell bioassay· Toxicol. In Vitrol995,9 :57 - 65.)〇然 而，為了減少動(dòng)物的使用，我們?nèi)孕枰⒖焖?，高通量的篩選方法，從而有效的監(jiān)測(cè)STX。 對(duì)于一種快速檢測(cè)方法而言，最關(guān)鍵的部分是STX的識(shí)別元件，如常用的抗體和受體等。然 而，目前常用的識(shí)別元件仍存在多種不足，例如，抗體的制備有限和動(dòng)物的使用等。
[0005] 核酸適配體是從隨機(jī)寡核苷酸序列庫中經(jīng)由SELEX(指數(shù)富集性配體系統(tǒng)進(jìn)化， Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技術(shù)篩選得到的一段 寡核苷酸序列。由于單鏈寡核苷酸序列容易形成發(fā)卡、假結(jié)、G-四連體等二級(jí)結(jié)構(gòu)，故能 與靶分子如藥物，蛋白質(zhì)，其他無機(jī)或有機(jī)分子高親和力特異性結(jié)合。相對(duì)于抗體，適配體 存在多種優(yōu)勢(shì)，包括其穩(wěn)定性，低免疫原性，強(qiáng)組織滲透性，高一致性，不需要?jiǎng)游锏?，故適 配體作為分析識(shí)別元件在檢測(cè)，診斷和治療方面都很有前景。據(jù)報(bào)道，NHI研宄團(tuán)隊(duì)已經(jīng) 通過SELEX技術(shù)篩選得到一條與STX特異結(jié)合的DNA適配體，APTSTX1，可以成為STX快速 高通量檢測(cè)中候選的分析識(shí)別元件APTstxi的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示（Handy，S. M. , Yakesj B. J. , DeGrassej J. a, Campbell, K. , Elliott, C. T. , Kanyuckj K. M. , Degrassej S. L First report of the use of a saxitoxin-protein conjugate to develop a DNA aptamer to a small molecule 如1；[11.1'01；!_(3011.2013,61，30 - 37)。然而，關(guān)于該適配體的 親和常數(shù)檢測(cè)、優(yōu)化及應(yīng)用尚無相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一條與石房蛤毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體。本發(fā)明 的另一目的是提供該適配體在制備樣品中痕量STX的分離富集試劑中、在制備石房蛤毒素 檢測(cè)試劑或試劑盒中、在制備預(yù)防或治療石房蛤毒素中毒藥物中，以及在制備去除水體中 石房蛤毒素制劑中等多方面的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的主要技術(shù)方案是：以APTstxi為基礎(chǔ)，通過突變和截短的方法進(jìn)行優(yōu)化得 到一條特異性結(jié)合STX的高親和力適配體，命名為M-30f。該寡核苷酸適配體可用于樣品中 痕量STX的分離富集，STX的分析檢測(cè)，中和石房蛤毒素鈉離子通道抑制作用的藥物的制 備，以及水體中毒素的去除。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，是提供了一條與石房蛤毒素特異性結(jié)合的高親和力適配體 (M-30f)，其核苷酸序列如下：
[0009] 5'-TTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACAGGTTCATTG-3'（SEQ ID NO :2)。
[0010] 本發(fā)明所述的寡核苷酸適配體，在其5'端或3'端可以進(jìn)行FITC、氨基、生物素或 地高辛化學(xué)修飾。
[0011] 2013年，NHI研宄團(tuán)隊(duì)通過磁珠法篩選得到可以與小分子STX相結(jié)合的適配體 APTSTX1，APTstxi的核苷酸序列如下：
[0012] 5 ' -GGTATTGAGGGTCGCATCCCGTGGAAACATGTTCATTGGGCGCACTCCGCTTTCTGTAGATGGCTC TAACTCTCCTCT-3'（SEQ ID N0:1)。
[0013] 本發(fā)明首先對(duì)APTsm進(jìn)行突變，期望從中找到親和力更高而并未通過SELEX篩選 出來的序列。我們?cè)O(shè)計(jì)了多條突變序列（包括單點(diǎn)突變及多點(diǎn)突變），將鳥嘌呤核苷酸任 一端或兩端的核苷酸也突變?yōu)轼B嘌呤核苷酸，因?yàn)轼B嘌呤核苷酸為G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)所必需。 借助QGRS Mapper軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，我們將可能折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行合成并 采用生物膜干涉的方法進(jìn)行親和力測(cè)定。與原始序列相比，其中部分序列親和力得到提高， 而親和力最高的是M-30，128nM，比APT sm提高了 30倍。在此基礎(chǔ)上，我們對(duì)M-30進(jìn)行進(jìn) 一步截短，分別將兩端的游離序列和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)逐個(gè)移除，并進(jìn)行親和力測(cè)定。通過對(duì)這些 截短序列的結(jié)構(gòu)與親和力之間的關(guān)系進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)其結(jié)合STX的核心序列是5'端的 兩個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。將其他多余的核苷酸移除后，我們得到M-30f，通過生物膜干涉的方法測(cè) 得其Kd值為133nM，保留了與STX的高親和力。并且該適配體與STX的基因類似物GTX2, 3 并不結(jié)合，表現(xiàn)出與STX結(jié)合的高特異性。
[0014] 本發(fā)明的第二方面，是提供了上述適配體M-30f在制備樣品中STX的分離富集試 劑中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供了上述適配體M_30f在制備石房蛤毒素檢測(cè)試劑或試劑盒中的應(yīng) 用。所述的試劑或試劑盒可用于快速檢測(cè)水體或水產(chǎn)品中的STX。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述適配體M_30f在制備預(yù)防或治療石房蛤毒素中毒藥物中的 應(yīng)用。所述的藥物也為中和石房蛤毒素鈉離子通道抑制作用的藥物、或?yàn)槭扛蚨舅剞卓?劑等。所述的藥物可以緩解、治愈石房蛤毒素中毒導(dǎo)致的惡心、嘔吐、腹瀉、神經(jīng)肌肉麻痹、 呼吸無力、血壓下降、心率減慢、心律失常等癥狀。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述適配體M-30f在制備去除水體或水產(chǎn)品中石房蛤毒素制劑 中的應(yīng)用。所述的制劑可以完全去除水體或水產(chǎn)品中的石房蛤毒素，或者降低水體或水產(chǎn) 品中石房蛤毒素的含量使其達(dá)到聯(lián)合國衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定及推薦的標(biāo)準(zhǔn)以 下。
[0018] 本發(fā)明通過多種方法，例如ELISA、細(xì)胞生物學(xué)分析和小鼠生物檢測(cè)等，對(duì)M-30f 與STX之間的相互作用進(jìn)行了研宄。研宄發(fā)現(xiàn)，M-30f不僅可以與STX結(jié)合，還能拮抗STX 的鈉離子通道抑制活性。作為STX的分子識(shí)別元件，M-30f具有很好的實(shí)際應(yīng)用前景，可以 用于樣品中痕量STX的分離富集，石房蛤毒素的快速檢測(cè)，中和石房蛤毒素鈉離子通道抑 制作用的藥物的制備，以及水體中毒素的去除。
[0019] 因此，本發(fā)明的M_30f面向?qū)嶋H應(yīng)用具有巨大的潛力。
【附圖說明】
[0020] 圖1是全長序列M-30經(jīng)mfold軟件預(yù)測(cè)得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0021 ] 圖2是M-30的截短序列的模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
[0022] 圖3是M-30f與STX的結(jié)合解離曲線。
[0023] 圖4是采用ELISA的方法研宄M-30f與STX之間的相互作用的結(jié)果。
[0024] 圖5是采用細(xì)胞學(xué)分析的方法對(duì)STX進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖6是采用細(xì)胞學(xué)分析的方法研宄M-30f與STX之間的相互作用的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除 非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此 外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí) 施方法與材料僅作示范之用。
[0027] 實(shí)施例1.適配體APTstxi的突變
[0028] 首先，我們向APTsm序列中引入單點(diǎn)突變。我們將序列中鳥嘌呤核苷酸任意一端 的核苷酸突變?yōu)轼B嘌呤核苷酸。通過這種方法，我們得到了 22條單點(diǎn)突變的寡核苷酸序列， 突變的位點(diǎn)分別是 3, 6,8, 12,13, 15, 20, 22, 25, 30, 32, 37, 41，43, 48, 50, 55, 57, 58, 60, 61 和64。根據(jù)QGRS Mapper軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果，22條突變序列中有9條序列（M-6, M-8, M-12， M-13，M-15，M-20，M-22，M-30和M-32)可能形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。我們將上述的9條序列合 成并采用生物膜干涉技術(shù)來評(píng)價(jià)它們的STX結(jié)合能力（見表1)。類似地，我們還引入了多 點(diǎn)突變，將鳥嘌呤核苷酸附近的兩個(gè)或三個(gè)核苷酸替代為鳥嘌呤核苷酸，合成了 6條可能 形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的序列，并通過生物膜干涉的方法評(píng)價(jià)其STX結(jié)合能力（見表2)。在得 到的眾多突變序列中，M-30與STX的親和力最高。
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