抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F-scFv及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體 2F-scFv，及其在生產(chǎn)治療B型肉毒毒素酶中毒藥物方面、檢測B型肉毒毒素酶方面的應(yīng)用， 還涉及篩選抗B型肉毒毒素酶活性的人源單鏈抗體2F- SCFv的底物。
【背景技術(shù)】
[0002] 肉毒毒素可導(dǎo)致人及動(dòng)物肉毒中毒，其感染劑量極低，從靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得出， 最低致死劑量（LD50)為lng/kg，因此，它已被美國疾病控制和預(yù)防中心指定為對人類的威 脅類似于炭疽的生物武器。導(dǎo)致肉毒中毒的原因大致分為四個(gè)類型，一、成人肉毒中毒。二、 嬰兒感染性肉毒中毒。三、傷口感染性肉毒中毒。
[0003] 肉毒毒素是肉毒梭菌在自然狀態(tài)下或者是在培養(yǎng)基中形成，通過細(xì)菌裂解釋放到 環(huán)境或培養(yǎng)液中，這種形態(tài)的毒素被稱為前體毒素，其分子量范圍在300 kDa到900 kDa。 前體毒素通常以復(fù)合體的形式存在，由神經(jīng)毒素（Bont)，由一個(gè)或多個(gè)能夠包圍和保護(hù)毒 素的非毒性蛋白組成，包括血凝素（HA)，非毒素非血凝素（NTNH)。臨床上所說的肉毒毒素 通常指具有神經(jīng)毒性作用的神經(jīng)毒素部分。
[0004] 肉毒毒素根據(jù)其抗原性的不同，共存在七種血清型（A、B、C、D、E、F、G、），盡管七種 血清型的肉毒毒素組成成分與它的作用機(jī)制略有差別，但是它們有著相近的分子量和相似 結(jié)構(gòu)。成熟肉毒毒素均由約150 kDa的單鏈多肽組成，蛋白質(zhì)成熟時(shí)通過細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白 酶將150kDa的單鏈多肽切割裂解成兩個(gè)不相等的多肽片段，兩個(gè)片段由一個(gè)二硫鍵連接， 形成一個(gè)分子量為50kDa的輕鏈片段（LC)和一個(gè)分子量為IOOkDa的重鏈片段（HC)。其中 輕鏈有一個(gè)催化功能域，重鏈包含分子量均為50kDa的兩個(gè)功能域，N端部分為跨膜域，C 端部分為神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合域。單獨(dú)的輕鏈和重鏈均無毒性，只有雙鏈才具有生物學(xué)毒性。
[0005] 輕鏈由細(xì)胞內(nèi)毒素蛋白組成，具有鋅離子依賴內(nèi)切酶活性，可抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋 放。肉毒毒素的活性區(qū)埋藏（~20 A深)于輕鏈中，表面負(fù)電荷，可通過一個(gè)通道獲得。梭狀 神經(jīng)毒素的活性位點(diǎn)包括一個(gè)單一的鋅原子，這個(gè)鋅原子歷來被認(rèn)為有功能，但是不起結(jié) 構(gòu)性作用。可以通過用金屬螯合劑去除鋅，但是通過在二級結(jié)構(gòu)上加入游離的鋅原子來重 新獲得鋅，毒素與底物結(jié)合的能力幾乎不變，但輕鏈的生物學(xué)活性卻大大的降低了，只相當(dāng) 于原來的30%。位于輕鏈中心有一個(gè)高度保守的鋅結(jié)合模塊HExxH (X是任意的氨基酸)序 列。HExxH序列中含有一個(gè)由3個(gè)組氨酸整合的鋅離子，并對突觸泡膜蛋白質(zhì)具有特異性 蛋白水解活性，這個(gè)催化位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)表面較深的裂縫中。
[0006] 在人類肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占據(jù)最重要的地位，其中A型肉 毒毒素輕鏈上的His 222，Glu223和His226殘基共同組成了鋅結(jié)合模塊HExxH序列的一 部分，并且在協(xié)調(diào)活性區(qū)鋅（His 222和His226)和一個(gè)水分子（Glu223殘基）的作用機(jī)制 中起了直接的作用。Glu261是協(xié)調(diào)鋅的第三配體。甚至有人認(rèn)為A型肉毒毒素的催化機(jī) 理與嗜熱菌蛋白酶是相似的，這是因?yàn)榛诮Y(jié)構(gòu)和序列相似的基礎(chǔ)上，他們的活性位點(diǎn)也 是相似的。從Glu223到Asp的突變使得活性幾乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素 失去了催化活性。通過對肉毒毒素結(jié)構(gòu)分析表明，A、B型肉毒毒素中與作用機(jī)制相關(guān)的關(guān) 鍵氨基酸殘基是相同的。與突觸泡蛋白結(jié)合的B型肉毒毒素的晶體結(jié)構(gòu)表明，Arg369和 Tyr372殘基位于接近被毒素裂解的肽鍵。肉毒毒素中中和殘基的突變使催化速度常數(shù)明顯 降低，但是不影響鋅結(jié)合和底物結(jié)合，人們提出，這些殘基在過渡態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮了作用。
[0007] 另外，在LC活性中心還有一些氨基酸殘基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。 它們的功能主要是維持和穩(wěn)定輕鏈活性中心的結(jié)構(gòu)和/或它與被結(jié)合底物的相對位置，以 此保證輕鏈最佳的酶解能力。
[0008] LC通過二硫鍵與HC的N端連接。在二硫鍵存在的狀態(tài)下，毒素重鏈HN結(jié)構(gòu)域形 成一條loop結(jié)構(gòu)，將深陷于輕鏈表面裂縫中的Zn 2+催化部位遮蔽住，從而不表現(xiàn)酶活性。在 雙鏈毒素進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞后，二硫鍵被還原，釋放出的輕鏈才能表現(xiàn)鋅離子內(nèi)肽酶活性，催化 部位能夠容納底物16個(gè)氨基酸殘基。催化部位的鋅離子除同4個(gè)組氨酸殘基的咪唑環(huán)、1 個(gè)結(jié)合于保守谷氨酸的水分子形成配位鍵外，還與另一分子的谷氨酸羧基形成配位鍵，1個(gè) 色氨酸分子很可能也參與鋅離子的配位。毒素輕鏈的這種獨(dú)特鋅離子配位形式、空間結(jié)構(gòu) 與其他所有已知的金屬蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)都不同，應(yīng)當(dāng)屬于一個(gè)新型的金屬蛋白酶家族。
[0009] 肉毒毒素的致病機(jī)理 1、靶細(xì)胞的識別與結(jié)合 前體毒素進(jìn)入胃腸道，在消化過程中，非毒素組分對神經(jīng)毒素起到保護(hù)作用，使其不會 受到各種消化酶和胃酸的侵蝕。由于分子量過大，毒素分子不是以擴(kuò)散的方式，而是以"內(nèi) 凹"和細(xì)胞攝入的方式通過腸粘膜上皮屏障，而不會破壞胃腸道。然后進(jìn)入小腸中，在小腸 的微堿性環(huán)境下，前提毒素中的神經(jīng)毒素解離出來，進(jìn)入血液及淋巴循環(huán)，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和交 感神經(jīng)處發(fā)揮其毒性作用。盡管神經(jīng)毒素可侵入不同的組織和器官，但不能穿透血腦屏 障，其惟一的親和靶點(diǎn)是外周膽堿能神經(jīng)末梢。在膽堿能神經(jīng)末梢，毒素的輕鏈能夠抑制 神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在神經(jīng)肌肉接頭處的釋放，導(dǎo)致肌肉麻痹。在這一毒性作用過程中，神經(jīng) 毒素的各功能域都有參與，具體的過程可分為三個(gè)階段。
[0010] 靶細(xì)胞的結(jié)合與內(nèi)化 在靶細(xì)胞的識別與結(jié)合這一過程中，肉毒毒素重鏈的結(jié)合域發(fā)揮了作用。結(jié)合域能夠 識別膽堿能神經(jīng)末梢，并與其發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)合域結(jié)合到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)節(jié)苷脂和 位于末端神經(jīng)細(xì)胞膜表面小結(jié)上的蛋白受體，特別是具有親和力的GDlb，GTlb和GQlb類 神經(jīng)節(jié)苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖組成的神經(jīng)節(jié)苷脂連接到神經(jīng)酰胺。通過對神經(jīng)節(jié) 苷脂分布及對其親和結(jié)合力的研宄，可以確定，神經(jīng)節(jié)苷脂不是唯一能促進(jìn)肉毒毒素結(jié)合 的分子，而雙受體模型的提出表明，在發(fā)生內(nèi)化作用前，肉毒毒素就已經(jīng)結(jié)合到了蛋白受體 上。盡管有一些證據(jù)表明，突觸結(jié)合蛋白可能參與了 A、B和E型的內(nèi)化作用，但是梭菌屬家 族每一個(gè)成員的受體，還沒有完全確定。每個(gè)毒素與其蛋白共受體都是特異性同源的，B型 肉毒毒素與唾液酸乳糖的混合物就與肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神經(jīng)毒素與神經(jīng)節(jié)苷 脂結(jié)合的一個(gè)〃鎖和鑰匙〃原理。這個(gè)觀察成功說明了一個(gè)觀點(diǎn)，那就是神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合 使肉毒毒素靠近蛋白受體，促進(jìn)了毒素的識別和內(nèi)化。
[0011] 一旦結(jié)合到神經(jīng)元表面，母體分子裂解，重鏈和輕鏈通過鋅原子結(jié)合到達(dá)神經(jīng)元 細(xì)胞膜，并且被內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞囊泡，形成一個(gè)包裹著毒素分子的酸性小囊泡。即內(nèi)化過程。 這一受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過程與時(shí)間，溫度及突觸活動(dòng)均有關(guān)。
[0012] 2、易位 肉毒毒素的輕鏈必須從囊泡小室或者胞內(nèi)體中出來，并且在H鏈N-末端作用下的通過 膜運(yùn)輸能夠成功進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)的靶蛋白，這一過程是稱為輕鏈易位。
[0013] 與其它梭菌毒素一樣，肉毒毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的酸性小泡后，會因 pH的變化而發(fā)生 結(jié)構(gòu)重組。盡管進(jìn)入突觸小泡和胞內(nèi)小泡是顯而易見，但是肉毒毒素易位進(jìn)入胞內(nèi)小泡的 特性尚未斷然確定。PH的降低使肉毒毒素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其在分子中有較大的疏 水性，并且增加了脂雙層的滲透性。這樣毒素的重鏈和輕鏈能夠嵌入小泡的脂雙層內(nèi)，一旦 嵌入，就會在磷脂雙層和PC12膜上形成離子通道。這個(gè)通道是具有選擇性的，分子量大的 分子無法通過，所以目前普遍認(rèn)為毒素輕鏈可以通過離子通道從小泡腔內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)細(xì)胞 胞質(zhì)。據(jù)此有三種輕鏈跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)假說模型，即管道模型（tunnel model)，裂縫模型（cleft model)和裂解模型（lysis model)。其中裂縫模型理論認(rèn)為，在低pH時(shí)，蛋白質(zhì)的分子構(gòu) 想發(fā)生了改變，此時(shí)HC可形成一個(gè)親水性的裂隙，并且在輕鏈穿膜過程中將其親水表面包 圍。在此模式中形成了親水性和疏水性的相互作用。輕鏈的羧基端因?yàn)槎蜴I與重鏈氨基 端相連而最先進(jìn)入到胞質(zhì)。實(shí)現(xiàn)易位后，由于胞質(zhì)的pH高于酸性小泡，使輕鏈結(jié)構(gòu)重新折 疊，重新回到具有催化活性。
[0014] 在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域發(fā)生構(gòu)象上的變化，最終跨越人工膜形成 離子通道，并且在體內(nèi)PH的環(huán)境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成 的離子通道與白喉毒素形成的相似，并且也是只在低PH下形成。肉毒毒素離子通道只允許 陽離子通過，但是可以在體外阻止氯喹。然而對于小孔徑離子通道的研宄，我們尚未清楚肉 毒毒素形成的通道是不是毒素輕鏈進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)的必經(jīng)之路。數(shù)據(jù)顯示，在低PH下輕鏈的 結(jié)構(gòu)有一個(gè)戲劇性的變化，就是可能產(chǎn)生一個(gè)選擇性的LC結(jié)構(gòu)并且更適合于易位。盡管這 在體內(nèi)還沒被證實(shí)，但是通過低PH誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變化是完全可逆的。
[0015] 肉毒毒素能夠在神經(jīng)傳遞發(fā)揮作用，就必須通過蛋白水解使LC與HN接頭處暴露 的表面產(chǎn)生缺口，從而使非活性的單鏈分子量為150-kDa的毒素活化。少數(shù)的細(xì)菌和組織 蛋白酶能夠?qū)崿F(xiàn)這個(gè)裂解反應(yīng)，并產(chǎn)生有活性的雙鏈神經(jīng)毒素。產(chǎn)生切口后，輕鏈和重鏈仍 然通過非共價(jià)鍵相互作用，并且由一個(gè)單一的二硫鍵連接。這種鏈間的二硫鍵（A型肉毒毒 素中的Cys430 - Cys454)的減少是輕鏈活化的第二階段，這是輕鏈自由進(jìn)入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞 質(zhì)溶膠和與底物間相互作用必不可少的階段。正如前面提到的，在低PH情況下，輕鏈有一 個(gè)戲劇性的變化。這種結(jié)構(gòu)的變化有助于易位帶(如果在易位點(diǎn)HN域確實(shí)是靠近輕鏈）的 重組和導(dǎo)致輕鏈的最終活化。神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以與肉毒毒素-LC活動(dòng)密切聯(lián)系在一 起的。因此，輕鏈活化的完成最終可能是發(fā)生在胞質(zhì)溶膠中的，緊接著從低PH的小室中易 位。
[0016] 3、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放 神經(jīng)小結(jié)處有突觸小囊泡，其中包含乙酰膽堿，它是能穿過神經(jīng)肌肉接頭刺激肌肉收 縮的一種神經(jīng)遞質(zhì)。該乙酰膽堿的小囊泡被一個(gè)叫做SNARE復(fù)合體的蛋白聚合物所結(jié)合。 為了穿過神經(jīng)肌肉交界處實(shí)現(xiàn)信號的傳遞，突觸前神經(jīng)小結(jié)中的乙酰膽堿小囊泡必須被釋 放到突觸間隙中。在這里，神經(jīng)遞質(zhì)在肌肉板上結(jié)合到特定受體上，觸發(fā)離子通道打開，從 而導(dǎo)致相鄰橫紋肌的去極化和收縮。乙酰膽堿的釋放，需要有SNA