克魯斯假絲酵母lsa及其在降解氨氮中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株克魯斯假絲酵母，以及該克魯斯假絲 酵母在降解氨氮中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的廢水和糞便在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的惡臭氣體，其中以 氨氣的危害最為明顯，輕者誘導(dǎo)家禽、豬等動(dòng)物呼吸道疾病的發(fā)生，引起動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，重 者可引起中毒死亡。同時(shí)大量的氨氣排放促進(jìn)可入肺顆粒物（PM2. 5)的形成，并擴(kuò)散到大 氣中與一些酸性物質(zhì)反應(yīng)，形成銨鹽氣溶膠，導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)富營(yíng)養(yǎng)化和酸化。此外，含有高 濃度氨氮的畜禽養(yǎng)殖廢水如果處理不當(dāng)，也會(huì)引起水體的富營(yíng)養(yǎng)化。因此，治理養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn) 過(guò)程中氨氣和氨氮的排放對(duì)保護(hù)人類(lèi)生態(tài)環(huán)境、改善動(dòng)物健康和福利具有重要意義。
[0003] 研宄表明，畜禽養(yǎng)殖廢水和糞便中氨氮和氨氣的產(chǎn)生很大程度上依賴(lài)于其中微生 物的代謝活動(dòng)，使通過(guò)調(diào)控環(huán)境微生物群落的活動(dòng)控制氨氮或氨氣的生成成為可能。而現(xiàn) 有的控制養(yǎng)殖場(chǎng)氨氣污染的措施大都采用物理方法（如加強(qiáng)舍內(nèi)通風(fēng)、建造糞尿分離設(shè)施 等），運(yùn)行成本高且因?yàn)闆](méi)有根本消除氨氮和氨氣對(duì)周邊環(huán)境的排放，仍會(huì)造成二次污染， 而采用微生物方法則能克服上述方法的缺陷，因此在治理畜牧養(yǎng)殖氨氣和氨氮污染方面具 有較高的應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供克魯斯假絲酵母LSA及其在降解氨氮中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供的克魯斯假絲酵母（Candida krusei) LSA，已于2015年02月11日保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所），保藏登記號(hào)為CGMCC NO. 10562?？唆斔?假絲酵母（Candida krusei) LSA CGMCC NO. 10562,簡(jiǎn)稱(chēng)克魯斯假絲酵母LSA。
[0006] 本發(fā)明還保護(hù)克魯斯假絲酵母LSA的培養(yǎng)物。
[0007] 本發(fā)明還保護(hù)克魯斯假絲酵母LSA的菌懸液。所述菌懸液具體可通過(guò)用無(wú)菌生理 鹽水重懸菌體得到。所述菌懸液中的菌濃度具體可為8. OX 108cfu/mL-9. OX 108cfu/mL。
[0008] 本發(fā)明還保護(hù)克魯斯假絲酵母LSA、所述培養(yǎng)物或所述菌懸液在制備產(chǎn)品中的應(yīng) 用；所述產(chǎn)品的功能為如下（a)或（b)或（c)或（d) : (a)降解氨氮；(b)降解水中的氨氮； (c)降解糞便中的氨氮；（d)降低糞便的氨氣散發(fā)量。所述糞便可為畜禽糞便，例如雞糞。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)一種產(chǎn)品，其活性成分為克魯斯假絲酵母LSA、所述培養(yǎng)物或所述菌 懸液；所述產(chǎn)品的功能為如下（a)或（b)或（c)或（d) : (a)降解氨氮；(b)降解水中的氨氮； (c)降解糞便中的氨氮；（d)降低糞便的氨氣散發(fā)量。所述糞便可為畜禽糞便，例如雞糞。 [0010] 本發(fā)明還保護(hù)克魯斯假絲酵母LSA、所述培養(yǎng)物或所述菌懸液在降解氨氮中的應(yīng) 用。所述降解氨氮具體可為降解水中的氨氮或降解糞便中的氨氮。所述糞便可為畜禽糞便， 例如雞糞。所述應(yīng)用中，溫度可為20-40 °C，具體可為30 °C。所述應(yīng)用中，pH值可為3. 0-7. 0， 具體可為7.0。所述應(yīng)用中，具體可以采用葡萄糖作為克魯斯假絲酵母LSA生長(zhǎng)所需的碳 源。所述應(yīng)用中，克魯斯假絲酵母LSA生長(zhǎng)所需碳氮質(zhì)量比可為10-40,具體可為20。
[0011] 本發(fā)明還保護(hù)克魯斯假絲酵母LSA、所述培養(yǎng)物或所述菌懸液在降低糞便的氨氣 散發(fā)量中的應(yīng)用。所述糞便可為畜禽糞便，例如雞糞。
[0012] 本發(fā)明還保護(hù)一種降解氨氮的方法，包括如下步驟：將克魯斯假絲酵母LSA、所述 培養(yǎng)物或所述菌懸液與含有氨氮的樣本混合，實(shí)現(xiàn)降解氨氮。
[0013] 本發(fā)明還保護(hù)一種降低糞便的氨氣散發(fā)量的方法，包括如下步驟：將克魯斯假絲 酵母LSA、所述培養(yǎng)物或所述菌懸液施加于糞便，從而降低糞便的氨氣散發(fā)量。所述糞便可 為畜禽糞便，例如雞糞。
[0014] 本發(fā)明還保護(hù)一種降低畜禽舍內(nèi)的氨氣濃度的方法，包括如下步驟：將克魯斯假 絲酵母LSA、所述培養(yǎng)物或所述菌懸液施加于畜禽舍內(nèi)，從而降低畜禽舍內(nèi)的氨氣濃度。
[0015] 本發(fā)明提供的克魯斯假絲酵母，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快、能耐受高濃度的氨 氮、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、安全性高。本發(fā)明提供的克魯斯假絲酵母可應(yīng)用于如下方面：（1)由于 其具有很強(qiáng)的氨氮降解能力，可用于改善氨氮污染的水質(zhì)問(wèn)題，適用于含高濃度氨氮的廢 水治理；（2)由于其可降低糞便氨氣的散發(fā)量，可用于畜禽舍內(nèi)，改善舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生；（3)其 生長(zhǎng)條件接近雞胃腸道的微環(huán)境，因此可作為雞的飼料添加劑使用，可以提高飼料中氮素 的利用率，在動(dòng)物糞便中存活的菌體又能進(jìn)一步減少氨氣的散發(fā)量，從而達(dá)到改善舍內(nèi)環(huán) 境的作用。本發(fā)明具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為克魯斯假絲酵母LSA的菌落圖片。
[0017] 圖2為克魯斯假絲酵母LSA的電鏡圖片。
[0018] 圖3為克魯斯假絲酵母LSA降解高濃度氨氮的曲線圖。
[0019] 圖4為溫度㈧和pH⑶對(duì)克魯斯假絲酵母LSA生長(zhǎng)的影響。
[0020] 圖5不同碳源㈧和C/N(B)對(duì)克魯斯假絲酵母LSA氨氮去除率的影響。
[0021] 圖6為克魯斯假絲酵母LSA對(duì)家禽糞便氨氣產(chǎn)生的控制效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。以下實(shí)施例中，用于制備各個(gè)培養(yǎng)基的水均為去離子水。以下實(shí)施例中用OD 6cicilJt 表征菌體生長(zhǎng)量。C/N即碳氮質(zhì)量比，又稱(chēng)碳氮比。
[0023] Yro液體培養(yǎng)基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，水lOOOmL，自然pH。
[0024] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：碳源、（NH4) 2S04、NaCl L 0g、K2HPO4 · 2Η200· 5g，MgSO4 · 7Η200· 25g，微 量元素溶液 I. 〇ml，水 1000mL，調(diào) ρΗ7· 2-7. 4。（NH4)2SO4S氮源。
[0025] 微量元素溶液：EDTA 10. 0g、ZnSO4L 2g、CaCl2L 5g、MnCl2 · 4H20 I. 0g、 FeSO4 · Η202· 0g、（NH4)6Mo7O24 · 4H20 I. 0g、CuSO4 · 5H20 lg、CoCl2 · 6H20 I. 0g，水 1000mL，調(diào) pH 7. 2-7. 4〇
[0026] 氨氮（NH4+-N)含量的測(cè)定方法采用水楊酸-次氯酸鹽光度法（GB7481 -1987)。
[0027] 實(shí)施例1、克魯斯假絲酵母LSA的分離純化及鑒定
[0028] 一、克魯斯假絲酵母LSA的分離純化
[0029] 1、氨氮降解菌的富集
[0030] 取20g雞糞樣品，接種于裝有100mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中（瓶中加入滅菌玻璃 珠），30°C、150r/min振蕩30min使菌膠團(tuán)充分打散，靜置20min。取上清液5ml，接種于裝 有100mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，30°C、150r/min振蕩培養(yǎng)2天，取Iml培養(yǎng)液再次接種于 新的富集培養(yǎng)基中，如此反復(fù)連續(xù)富集10代。
[0031] 2、氨氮降解菌的篩選、分離和純化
[0032] 吸取富集培養(yǎng)液1ml，經(jīng)KT1梯度稀釋后，取200 μ 1涂布于分離平板上，30°C培養(yǎng) 24~72h。24h后開(kāi)始觀察菌的生長(zhǎng)情況，選取生長(zhǎng)快、菌落大、數(shù)量多的菌落采用三線法進(jìn) 行純化。純化3代后，分別進(jìn)行4°C斜面保存。
[0033] 將分離純化后的供試菌株接種于活化培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)18_24h。然后按 10%的接種量接種于無(wú)菌離心管中，4000r/min離心10min，棄上清液，用0. 86%無(wú)菌生 理鹽水洗滌三次，最后用同體積的無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，接種于50ml篩選培養(yǎng)基中， 30°C、150r/min振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)定氨氮含量，篩選出一株降解效果最好的菌株，命名為 LSA0
[0034] 二、菌種的鑒定
[0035] 1、形態(tài)觀察
[0036] 將LSA菌株接種在YPD固體培養(yǎng)基平板上，觀察菌落形態(tài)特征。LSA菌株的菌落 照片見(jiàn)圖1，電鏡照片見(jiàn)圖2。LSA菌株呈點(diǎn)狀，白色、不透明，邊緣光滑，凸起，無(wú)光澤，菌株 為卵圓形、易堆積。
[0037] 2、生化鑒定
[0038] 采用生物梅里埃（biomerieux)Vitek32-YST鑒定卡片對(duì)LSA菌株進(jìn)行生理生化鑒 定，鑒定結(jié)果為Candida krusei。
[0039] 3、分子生物學(xué)鑒定
[0040] 對(duì)LSA菌株的18S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，將純化后的PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如序列表 的序列1所示。
[0041] 綜合形態(tài)鑒定、生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，LSA菌株屬于克魯斯假絲酵母 (Candida krusei)〇
[0042] 克魯斯假絲酵母（Candida krusei)LSA，已于2015年2月11日保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所），保藏登記號(hào)為CGMCC NO. 10562?？唆斔辜俳z酵母 (Candida krusei) LSA CGMCC NO. 10562,簡(jiǎn)稱(chēng)克魯斯假絲酵母 LSA。
[0043] 實(shí)施例2、克魯斯假絲酵母LSA降解氨氮功能的研宄
[0044] 一、克魯斯假絲酵母LSA對(duì)高濃度氨氮的降解特性研宄
[0045] 1、制備培養(yǎng)基甲
[0046] 培養(yǎng)基甲：采用葡萄糖作為唯一碳源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上調(diào)整碳源和 (NH4) 2SO4的濃度，使氨氮濃度為1200mg/L，C/N為10, pH為7. 0。
[0047] 2、挑取克魯斯假絲酵母LSA單克隆，接種于IOOmL ΥΗ)液體培養(yǎng)基中，30°