一種對(duì)克羅諾桿菌o抗原特異的核苷酸及其應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種對(duì)克羅諾桿菌O抗原特異的核苷酸及其應(yīng)用
[0001] 本發(fā)明申請(qǐng)是【申請(qǐng)?zhí)枴?01410150358. 2,申請(qǐng)日：2014. 04. 16,發(fā)明名稱(chēng)：一種對(duì) 克羅諾桿菌0抗原特異的核苷酸及其應(yīng)用的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種對(duì)克羅諾桿菌0抗原基因簇特異的核苷酸，尤其涉及一種對(duì)克羅 諾桿菌〇抗原基因簇中單個(gè)基因特異的核苷酸。
【背景技術(shù)】
[0003] frofloAacier(克羅諾桿菌)是最近新分類(lèi)的一個(gè)屬，原稱(chēng)Enterobactersakazakii (阪崎腸桿菌)。2007-2008年由種上升為屬，成為腸桿菌科的一個(gè)新屬目前 "S? 7 Cronobacter sakazakii, C. malonaticus, C. muytjensii, C. dublinensis, C. 和C wfliFersa/is?，F(xiàn)有研宄表明，所有克羅諾桿菌不同菌株之 間有著明顯的致病性差異，其中和嬰幼兒感染相關(guān)的菌集中在C malonaticus 熱 C dublinensist。
[0004] 克羅諾桿菌是重要的食源性致病菌，分布廣泛，在嬰幼兒奶粉、奶酪、腌肉、水、蔬 菜、大米、面包、茶葉、草藥、調(diào)味料以及豆腐等多種食品中被檢測(cè)到。在對(duì)一些新生兒克羅 諾桿菌感染事件的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)嬰幼兒奶粉是主要感染渠道。隨著一系列與該菌相關(guān)的奶粉 召回和重大感染事件的爆發(fā)，嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌的感染問(wèn)題受到全世界的普遍 關(guān)注，已被世界衛(wèi)生組織和許多國(guó)家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，可導(dǎo)致任 何年齡層人群的疾病，尤其是對(duì)早產(chǎn)兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，嚴(yán) 重者可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結(jié)腸炎，死亡率可達(dá)40 %~80%。世界衛(wèi)生組織 (WHO)和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)相繼在2004年和2006年召開(kāi)了討論該菌的會(huì)議。
[0005] 目前克羅諾桿菌的分類(lèi)地位剛剛建立，其0抗原血清型的研宄也逐漸成為熱點(diǎn)。 脂多糖是革蘭式陰性細(xì)菌的主要表面成分，包括類(lèi)脂A，核心多糖和0抗原。0抗原是革蘭 氏陰性細(xì)菌脂多糖分子的最外層結(jié)構(gòu)，它是由多個(gè)寡糖重復(fù)單位組成的多糖鏈，重復(fù)單位 一般由3~6個(gè)單糖組成。在大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和志賀氏菌中，負(fù)責(zé)0抗原合成的基因相 鄰排列于兩個(gè)持家基因 galF和gnd之間，在染色體上形成一個(gè)基因簇。0抗原基因簇內(nèi)部 的基因通常分為三類(lèi)：?jiǎn)翁呛铣擅富颉⑻腔D(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理酶基因。單糖合成 酶負(fù)責(zé)單糖前體的合成，糖基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)將單糖串聯(lián)成寡糖重復(fù)單位，而寡塘單位處理酶 負(fù)責(zé)將寡糖單位從內(nèi)膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜外側(cè)，并將寡糖單位進(jìn)行串聯(lián)。
[0006] 脂多糖特別是其中的0-抗原的組成和結(jié)構(gòu)的變化決定了革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞表 面抗原決定簇的多樣性，比如國(guó)際上根據(jù)脂多糖的結(jié)構(gòu)特性而鑒定過(guò)沙門(mén)氏菌屬的抗原類(lèi) 型多達(dá)2107個(gè)。血清分型是一種經(jīng)典和常用的流行病學(xué)調(diào)查手段，對(duì)于臨床研宄及疫苗研 制具有重要意義。這種診斷方法需要大量的抗血清，而抗血清一般種類(lèi)不全，數(shù)量不足，大 量的抗血清在制備和儲(chǔ)存中也存在一些困難。另一方面此法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、漏檢率高、 準(zhǔn)確性差，不同的〇抗原產(chǎn)生的抗血清之間經(jīng)常存在交叉反應(yīng)。因此，建立基于分子生物 學(xué)技術(shù)的血清鑒定方法成為目前的發(fā)展方向?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為這種傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法將 為現(xiàn)代分子生物學(xué)方法取代。
[0007] 近年來(lái)，越來(lái)越多的分子技術(shù)用于病原菌的分型、鑒定、檢測(cè)及病害診斷，包括轉(zhuǎn) 錄間隔區(qū)（ITS)序列分析、隨機(jī)擴(kuò)增長(zhǎng)度多態(tài)性（RAPD)分析、核糖體DNA限制性片段長(zhǎng)度 多態(tài)性（RFLP)分析等。分子生物學(xué)方法不僅可用于阪崎腸桿菌的快速血清分型篩查，穩(wěn)定 的鑒定結(jié)果可以彌補(bǔ)表型特征鑒定方法的不足。和傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，這些基于多聚酶鏈 式反應(yīng)（PCR)的分子檢測(cè)技術(shù)，不需要經(jīng)過(guò)病原菌的分離、純培養(yǎng)等過(guò)程，而且具有快速、 靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 不同抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶和寡糖單位處理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型 特異性，可用作靶基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。寡糖單位處理酶基因包括〇抗原轉(zhuǎn)運(yùn)酶基因 (wzx)和0抗原聚合酶基因（wzy)。利用上述兩個(gè)基因作為血清型分型檢測(cè)的特異靶基因 是十分理想的。如大腸桿菌（王威，彭霞，2006年)、變形桿菌和沙門(mén)氏菌均有利用該基因做 特異檢測(cè)的實(shí)例。
[0009] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase chain reaction,簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù)）作為微生物 檢測(cè)技術(shù)目前正在得到認(rèn)同和推廣，該技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的方法有高通量、檢測(cè)速度快、特異 性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，只需對(duì)樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)增菌或增菌過(guò)程，再通過(guò)離心及裂解制備 細(xì)菌DNA模板，就可以在高特異性引物介導(dǎo)下的PCR過(guò)程中擴(kuò)增目標(biāo)序列，達(dá)到檢測(cè)樣品中 是否含有待測(cè)的致病性微生物的目的。PCR的擴(kuò)增過(guò)程僅需1個(gè)半小時(shí)。這對(duì)檢驗(yàn)檢疫部 門(mén)和臨床檢驗(yàn)無(wú)疑極大提高了工作速度和降低了工作成本。不論從國(guó)內(nèi)和國(guó)際的角度來(lái) 看，快速、準(zhǔn)確地鑒定出血清類(lèi)型，為克羅諾桿菌的防控提供有效技術(shù)支持是十分重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供了一種對(duì)克羅諾桿菌〇抗原基因特異的核苷酸，其特 征在于所述核苷酸為： 1) SEQ ID NO: 1-12所示的核苷酸中的至少一種 2) 與SEQ ID N0:l-12所示的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸中的至少一種。其中所述互補(bǔ) 的核苷酸指的是由SEQ ID NO: 1-12所示的核苷酸按照堿基配對(duì)原則（A=T，G = C)得出 的與它們互補(bǔ)的核苷酸，如SEQ ID N01: 5'GAAGCGGCAGATTCATTTA 3'的互補(bǔ)核苷酸為 5 'TAAATGAATCTGCCGCTTC 3'。
[0011] 本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供了一種用于檢測(cè)克羅諾桿菌的PCR試劑盒，包括PCR 引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，所述PCR引物如SEQ ID NO: 1-12所示核苷酸中的至少 一種。如用于檢測(cè)01的引物SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2,和用于檢測(cè) C AzWiflez7lSi1S 02 引物 SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
[0012] 這種試劑盒，還包括如下試劑：10 mM dNTP 30yL ;10X酶特異性反應(yīng)緩沖液 50yL ;5 U/yL 耐熱 DNA 聚合酶 5yL ;引物 1 (10μΜ) 10μ 1 ;引物 2 (10μΜ) 10μ 1 ;陽(yáng) 性對(duì)照品10 μ L ;陰性對(duì)照品10 μ L ;ddH20 5mL。
[0013] 本發(fā)明再一個(gè)目的在于提供了所述核苷酸在制備用于檢測(cè)克羅諾桿菌的基因芯 片中的應(yīng)用。所述的基因芯片為微列陣芯片。包括固相載體和固定在固相載體上的寡核苷 酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸如SEQ ID NO: 1-12所 示的核苷酸中的至少一種。
[0014] 本發(fā)明公開(kāi)的用于快速檢測(cè)克羅諾桿菌的核苷酸與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以 下優(yōu)點(diǎn)： (1)實(shí)用性強(qiáng) 應(yīng)用本發(fā)明所配制的PCR試劑盒等配制方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短、速度快，可操作性強(qiáng)， 易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，而檢測(cè)成本卻相對(duì)較低。
[0015] (2)準(zhǔn)確性高 本發(fā)明設(shè)計(jì)了對(duì)克羅諾桿菌0抗原基因特異的引物，以克羅諾桿菌的基因組為模板做 PCR能夠得