一種防治葡萄霜霉病的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對(duì)葡萄霜霉病有防治作用的地衣芽孢桿菌{BacillusIicheniformis)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄霜霉病(Grape Downy Mildew)是葡萄上的主要病害之一,病原為葡萄生單軸霉XPlasmopara viticola),屬于色藻界,卵菌綱,霜霉菌目,霜霉科,單軸霉屬,是一種專性寄生卵菌。病菌的菌絲體為無(wú)隔、多核菌絲,在寄主細(xì)胞間生長(zhǎng)蔓延并吸取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。病菌的孢子囊及孢囊梗密集于發(fā)病部位形成白色霜霉層。孢子囊在適宜的溫濕度環(huán)境條件下萌發(fā)產(chǎn)生6?10個(gè)游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子無(wú)色,成蠶豆?fàn)?,大小?.5?9X6?7μπι,能在水中游動(dòng)。孢子囊釋放的游動(dòng)孢子一般會(huì)游動(dòng)30分鐘左右,然后停止活動(dòng),鞭毛收縮,變成圓形,再經(jīng)過(guò)大約15分鐘開始萌發(fā)產(chǎn)生芽管,從由葉背氣孔侵入寄主。一般經(jīng)過(guò)10?20天的潛育期,病原菌在寄主細(xì)胞間擴(kuò)散并吸取足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后開始發(fā)病。
[0003]葡萄霜霉病的流行總是反復(fù)發(fā)生,病害的傳播需要依賴于雨水、露珠和氣流。當(dāng)溫度介于11?33°C之間,卵孢子在具有充足水分的條件下開始萌發(fā),生出孢囊梗并在頂部形成孢子囊,通過(guò)雨水、露珠和氣流傳播。孢子囊借雨水飛濺到葡萄幼嫩組織,萌發(fā)產(chǎn)生游動(dòng)孢子對(duì)葡萄進(jìn)行初侵染。發(fā)病一般要經(jīng)過(guò)孢子囊萌發(fā),釋放游動(dòng)孢子和侵入寄主三個(gè)過(guò)程。
[0004]防治葡萄霜霉病主要是通過(guò)避雨栽培;與矮桿作物套種;清除菌源;合理施肥等農(nóng)業(yè)措施,以及利用化學(xué)藥劑來(lái)防治葡萄霜霉病。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外開始篩選一些微生物來(lái)防治植物葡萄霜霉病。2011年陳浩等發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌subti I is) B-FSOl能產(chǎn)生脂肽類抗菌物質(zhì),其發(fā)酵液和無(wú)菌濾液在室內(nèi)和田間對(duì)霜霉病均有很高防效(植物保護(hù),2011,37 (6): 194-197)。2014年臧超群等篩選到的SY286在離體葉片上對(duì)葡萄霜霉病防效可達(dá)93.18%,經(jīng)鑒定為蒼白桿菌應(yīng)sp.)(中國(guó)生物防治學(xué)報(bào),2014,30(3):402-407)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對(duì)上述問(wèn)題,發(fā)明人從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園附近采集土壤樣品,利用LB培養(yǎng)基通過(guò)稀釋平板法獲得細(xì)菌的單菌落。由于葡萄霜霉病菌為專性寄生卵菌,目前還不能夠在培養(yǎng)基上進(jìn)行人工培養(yǎng),從土壤中所得到的細(xì)菌無(wú)法在培養(yǎng)皿中直接與葡萄霜霉病菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。因此,先用與葡萄霜霉病菌親緣關(guān)系較近的黃瓜疫霉菌{Phytophthora me I on is)與土壤中所得到的細(xì)菌措抗試驗(yàn),篩選對(duì)黃瓜疫霉菌{Phytophthora me I on is)有抑制作用的細(xì)菌。在此基礎(chǔ)上,再通過(guò)離體葉盤法檢測(cè)對(duì)葡萄霜霉病的防治作用。
[0006]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種對(duì)葡萄霜霉病有防治作用的細(xì)菌,其是保藏號(hào)為CGMCC N0.10043的地衣芽孢桿菌P3,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0007]該細(xì)菌為地衣芽孢桿菌(拉丁名'Bacillus Ii cheni formi 5.)Ρ3已于2014年11月_I日為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)),其保藏號(hào)為CGMCC N0.10043,經(jīng)檢測(cè)存活。
[0008]同時(shí),本發(fā)明還提供所述的細(xì)菌在防治葡萄生單軸霉vi ticola)所致植物病害中的應(yīng)用,尤其是防治葡萄霜霉病中的應(yīng)用。
[0009]所述的應(yīng)用,是利用所述細(xì)菌的發(fā)酵液、發(fā)酵液提取物進(jìn)行應(yīng)用。
[0010]所述的應(yīng)用,所述的植物病害是葡萄霜霉病。
[0011]本發(fā)明還提供一種農(nóng)用殺菌劑,其包含所述的細(xì)菌,優(yōu)選的是其包含所述菌株的發(fā)酵液,或其發(fā)酵液提取物。
[0012]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明細(xì)菌對(duì)人畜無(wú)致病性,是一種能安全、無(wú)毒、有效的防治葡萄霜霉病的拮抗細(xì)菌。目前國(guó)內(nèi)鮮有對(duì)葡萄霜霉病拮抗菌的報(bào)道,尤其是沒(méi)有報(bào)道地衣芽孢桿菌對(duì)葡萄霜霉病的防治作用。因此,該拮抗菌株對(duì)防治葡萄霜霉病具有重大的開發(fā)潛力。本發(fā)明細(xì)菌的發(fā)酵液稀釋100-200倍,噴霧,噴施三次后,對(duì)葡萄霜霉病有62.6%-76.8%的防治效果,具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。
[0013]
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為對(duì)峙篩選抑制黃瓜疫霉菌的細(xì)菌P3。
[0015]圖2為地衣芽孢桿菌P3菌株LB發(fā)酵濾液的不同稀釋對(duì)葡萄霜霉病的抑制作用。
[0016]圖3為細(xì)菌P3革蘭氏染色。
[0017]圖4為細(xì)菌P3鞭毛染色。
[0018]圖5為細(xì)菌P3的PCR圖。
[0019]圖6為細(xì)菌P3的16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0020]
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面提供實(shí)施例以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0022]實(shí)施例1:菌株的篩選和鑒定
本發(fā)明對(duì)葡萄霜霉病有防治作用的細(xì)菌的篩選方法如下:
1、土壤樣品的采集
從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)附近隨機(jī)采集土樣5份。去除表面土壤,采集5-20cm深處的土樣約300g,分裝標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室。
[0023]2、細(xì)菌的分離
采用土壤稀釋法分離,稱取1g 土壤倒入裝有玻璃珠的90ml無(wú)菌水三角瓶中,振蕩1min后為KT1的稀釋液,并將此以十倍稀釋的方式,稀釋成10 _5,10_6,10_7的稀釋液。吸取10_6和10 _7稀釋液10ul加入到LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化鈉10克、瓊脂20克、蒸餾水1000ml,pH 7.2),每個(gè)梯度3次重復(fù),涂布均勻,倒置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0024]3、拮抗細(xì)菌的篩選
在采用平板對(duì)峙法篩選對(duì)黃瓜疫霉菌有抑制作用細(xì)菌的基礎(chǔ)上(圖1),利用離體葉盤法檢測(cè)對(duì)葡萄霜霉病的防治作用:將對(duì)黃瓜疫霉菌有抑制作用的細(xì)菌用LB培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)4天,微孔濾膜過(guò)濾,將濾液用滅菌水稀釋到5倍、10倍、20倍、40倍和80倍,用打孔器將生長(zhǎng)健壯完好的、對(duì)葡萄霜霉病菌比較感病的品種滬太8號(hào)的葉片打成直徑1.5cm的葉盤,將葉盤放到稀釋后的培養(yǎng)濾液中浸泡30秒,每個(gè)稀釋濃度浸泡20個(gè)葉盤,對(duì)葡萄霜霉病菌比較感病的品種滬太8號(hào)的葉片打成直徑1.5cm的葉盤,將葉盤放到稀釋后的培養(yǎng)濾液中浸泡30秒,每個(gè)稀釋濃度浸泡20個(gè)葉盤,瀝干濾液后,將20個(gè)葉盤用放在同一張用蒸飽水濕潤(rùn)的濾紙上,橫5豎4排列。前3橫排15個(gè)葉盤上滴一滴20μ1濃度為IX 16葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液,第4橫排5個(gè)葉盤滴20μ1蒸餾水作為對(duì)照。用保鮮膜封住托盤保濕。放于22°C,相對(duì)濕度95%,16 h光照和8 h黑暗條件下的人工氣候箱培養(yǎng)6?6 d,進(jìn)行發(fā)病調(diào)查,統(tǒng)計(jì)病情指數(shù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取平均值。篩選結(jié)果請(qǐng)見圖2。
[0025]4、拮抗菌的鑒定
(I)形態(tài)特征觀察
細(xì)菌P3菌落不透明,圓形,革蘭氏染色陽(yáng)性(圖3),菌體桿狀、端圓,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)(圖
4)0
[0026](2)生理生化實(shí)驗(yàn)
具體參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、《一般細(xì)菌常用鑒定方法》,對(duì)細(xì)菌P3進(jìn)行過(guò)氧化氫酶、吲哚試驗(yàn)、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解、產(chǎn)H2S等各項(xiàng)試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)細(xì)菌P3能夠厭氧生長(zhǎng)、水解淀粉、過(guò)氧化氫酶、明膠液化、M.R.-V.P.和硝酸鹽還原呈陽(yáng)性,吲哚試驗(yàn)和產(chǎn)H2S試驗(yàn)均為陰性,能利用D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖產(chǎn)酸,不能利用葡萄糖產(chǎn)氣,耐溫55°C生長(zhǎng)。
[0027](4 ) 16S rDNA測(cè)序及序列分析
用CATB方法提取細(xì)菌基因組的DNA。用16S rDNA的細(xì)菌通用引物,正向引物27F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物 1492R: 5’ -CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’,25μ? 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增:10XPCR BPffer緩沖液2.5μ?,正反引物(1pmolPL)各0.5μ?,dNTPs(l.25mmolPL)2PL,TaqDNA 酶(5/>L)0.3μ?, DNA 模板(50ng/^L)0.5μ?, ddH20 加至25μ?。PCR 擴(kuò)增條件:94°C 4min 預(yù)變性,94°C 45sec,55°C 45sec,72°C lmin,共 30 個(gè)循環(huán),72°C 1min修復(fù)延伸,4°C ^終止反應(yīng)。得到1500bp左右的片段(圖5)。經(jīng)試劑盒純化后,與T載體進(jìn)行連接,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,挑克隆子,菌液PCR驗(yàn)證,送到生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,序列為1456bp(請(qǐng)見SEQ ID N0.1所示)。所測(cè)序列登陸NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比較,并采用CLUSTAL(X)、MEAG (5.0)軟件進(jìn)行多重序列比較,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)發(fā)現(xiàn),所測(cè)序列與地衣芽孢桿菌{Bacillus Ii cheni formi s)的16S rDNA有非常高的一致性(99%),結(jié)合形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)表明該菌為地衣芽孢桿菌。
[0028]實(shí)施例2:應(yīng)用實(shí)施例
2014年4月在湖南省懷化市中方縣桐木鎮(zhèn)進(jìn)行了地衣芽孢桿菌(BacillusHcheniformis)??,菌株的發(fā)酵液防治葡萄霜霉病的田間藥效試驗(yàn)。供試葡萄品種為刺葡萄,試驗(yàn)地面積約1.2畝,土質(zhì)為淺黑色壤土,肥力中等,排灌方便。每畝施用鉀肥25公斤,復(fù)合肥15公斤,菜餅120公斤,有機(jī)肥300公斤,田間管理按正常進(jìn)行,試驗(yàn)期間不再噴施其他殺菌劑防治葡萄霜霉病。試驗(yàn)設(shè)計(jì)為供試微生物發(fā)酵液母液稀釋200倍液和100倍液,對(duì)照藥劑50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1500倍液和空白對(duì)照4個(gè)處理,小區(qū)面積20 m2,重復(fù)4次,隨機(jī)區(qū)組排列,小區(qū)四周設(shè)保護(hù)株。
[0029]2014年4月25日(發(fā)病初期)第一次施藥,7天后,5月2日第二次施藥,第二次施藥14天后,5月16日施第三次藥。每次下午4點(diǎn)左右施藥。按試驗(yàn)方案,配制成相應(yīng)的溶液,每畝噴施藥液60千克的用量。施藥時(shí)先噴清水對(duì)照區(qū),再噴施對(duì)照藥劑,藥液均勻噴灑在葉面及葉背。
[0030]2014年4月25日第一次施藥前,刺葡萄霜霉病還處于發(fā)生初期,調(diào)查試驗(yàn)區(qū)域葡萄霜霉病的發(fā)生都比較輕,忽略其初始病情。第三次施藥后14天(2014年5月30日)對(duì)防治效果進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)P3微生物發(fā)酵液稀釋100倍、200倍、對(duì)照藥劑50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1500倍液,在第三次施藥后14天,對(duì)葡萄霜霉病的平均防效分別為76.8%,62.6%和87.0%。雖然P3發(fā)酵液噴霧對(duì)葡萄霜霉病的防治效果沒(méi)有對(duì)照藥劑50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1500倍液的防效好,但作為微生物發(fā)酵液稀釋100-200倍,有62.6%_76.8%的防治效果,具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種防治葡萄霜霉病的細(xì)菌,其是保藏號(hào)為CGMCC N0.10043的地衣芽孢桿菌{Bacillus Iicheni formis)。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌在防治葡萄生單軸霉(Plastnopara所致植物病害中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于:其利用所述細(xì)菌的發(fā)酵液、發(fā)酵液提取物進(jìn)行應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用,其特征在于:所述的植物病害是葡萄霜霉病(GrapeDowny Mildew)。
5.一種農(nóng)用殺菌劑,其特征在于:其包含如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌。
6.如權(quán)利要求5所述的農(nóng)用殺菌劑,其特征在于,其包含如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌的發(fā)酵液,或其發(fā)酵液提取物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對(duì)葡萄霜霉病有防治作用的細(xì)菌及其篩選方法,其是保藏號(hào)為CGMCC No. 10043的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)P3菌株,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。該細(xì)菌對(duì)人畜無(wú)致病性,是一種能安全、無(wú)毒、有效的防治葡萄霜霉?。℅rape Downy Mildew)的拮抗細(xì)菌。該拮抗菌株對(duì)防治葡萄霜霉病具有重大的開發(fā)潛力。CGMCC No. 1004320141121
【IPC分類】A01P3-00, C12N1-20, A01N63-00, C12R1-10
【公開號(hào)】CN104845906
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510137951
【發(fā)明人】易圖永, 楊帆, 劉雙清, 孫莉
【申請(qǐng)人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年3月26日