低分子肝素-甘草次酸聚合物及其合成方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種納米聚合物自組裝膠束材料(低分子肝素-甘草次酸聚合物)的合成，尤其是指低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成及以該聚合物作為生物材料制備抗腫瘤藥物納米膠束制劑的應(yīng)用方法。本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料和納米藥物制劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]幾十年來，惡性腫瘤的發(fā)生率和死亡率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的多發(fā)病之一。有研宄預(yù)測至2050年僅亞太地區(qū)的惡性腫瘤新發(fā)病例和死亡人數(shù)便將達(dá)到730萬和550萬，是2000年的2倍以上。而其中肝癌被稱為“癌中之王”，其治愈率低，死亡率高。而我國是世界上肝癌的高發(fā)區(qū)，近20年來肝癌死亡率增加了 41.7%，全世界每年約有125萬人死于肝癌，其中近一半發(fā)生在我國。肝癌早期癥狀較為隱匿不易察覺，但一旦表現(xiàn)出明顯癥狀，其惡性程度高，發(fā)展迅速，若治療不及時(shí)或治療方案選擇不當(dāng)，平均生存期僅為半年。目前，針對(duì)肝癌的臨床治療，為了彌補(bǔ)手術(shù)療法的不徹底性和易誘發(fā)轉(zhuǎn)移的缺點(diǎn)，化學(xué)療法作為輔助治療手段依然占據(jù)著非常重要的地位。然而，傳統(tǒng)的基于細(xì)胞毒性的化學(xué)治療藥物在通過全身給藥方式獲得治療效果的同時(shí)對(duì)人體正常的臟器也存在著較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，繼而引發(fā)嚴(yán)重的毒副作用。例如紫杉醇是從紅豆杉屬植物中提取分離得到的一種天然抗癌活性成分。作為一種高效的細(xì)胞毒類抗癌藥，其臨床制劑泰素注射液曾長時(shí)間作為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及急性白血病的一線藥物使用。但是其溶媒聚氧乙烯蓖麻油易產(chǎn)生諸如神經(jīng)毒性、心臟毒性、腎毒性、過敏反應(yīng)等毒副作用，加之紫杉醇的全身分布會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟毒性和腎毒性，因此如何在術(shù)后的肝癌患者身上運(yùn)用溫和的、可耐受的化學(xué)治療手段以降低化學(xué)療法帶來的潛在危險(xiǎn)是需要醫(yī)藥領(lǐng)域研宄人員需要亟需解決的問題。
[0003]納米給藥系統(tǒng)是近年來抗腫瘤藥物劑型開發(fā)和遞送領(lǐng)域的研宄熱點(diǎn)。它通過納米載體材料將化學(xué)藥物包裹或分散于納米級(jí)的基質(zhì)當(dāng)中，有效地改善難溶性藥物的溶解性，延長藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，改變藥物的體內(nèi)分布，提高藥物生物利用度，并且具有一定的靶向性。這些優(yōu)點(diǎn)可以有效降低化療過程中的非特異性不良反應(yīng)，提高治療效能，尤為適用于腫瘤的治療。其中，聚合物膠束系統(tǒng)憑借其低毒性和良好的穩(wěn)定性在難溶性藥物的增溶和遞送領(lǐng)域備受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。它是由兩親性的高分子聚合物在水中通過疏水基團(tuán)的分子內(nèi)和分子間作用力自發(fā)形成的一種具有典型核殼結(jié)構(gòu)的自組裝結(jié)構(gòu)。這種膠束系統(tǒng)由緊密的疏水內(nèi)核和親水性的外殼組成，因其內(nèi)核可以通過疏水作用力等包載一些難溶性藥物，因此該系統(tǒng)被認(rèn)為是一種有前景的難溶性藥物的遞送載體。然而，這些納米給藥系統(tǒng)并不具備從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)逃逸的能力，在體內(nèi)很容易被單核巨噬細(xì)胞吞噬而清除。另一方面，這種依靠制劑納米級(jí)粒徑實(shí)現(xiàn)的被動(dòng)靶向依然存在腫瘤部位自聚物攝取不充分、甚至引發(fā)多藥耐藥從而降低療效的現(xiàn)象。為了完成腫瘤納米系統(tǒng)的靶向給藥，利用體內(nèi)的特異性分子識(shí)別機(jī)制，在納米載體表面偶聯(lián)靶標(biāo)分子已成為一種較為成熟的靶向策略。
[0004]早在20世紀(jì)90年代初，Negishi即證實(shí)了大鼠肝細(xì)胞膜組分中含有大量的甘草次酸結(jié)合位點(diǎn)，且呈現(xiàn)高度特異性。隨后以甘草次酸為靶標(biāo)分子修飾的載體材料被國內(nèi)外諸多學(xué)者所報(bào)道，比如，以甘草次酸作為疏水基團(tuán)構(gòu)建聚合物膠束系統(tǒng)的甘草次酸修飾的透明質(zhì)酸聚合物和甘草次酸修飾硫酸酯殼聚糖聚合物；通過水溶性PEG長鏈將甘草次酸作為革巴向分子分布在聚合物表面的甘草次酸修飾的PEG - b-poly( γ-benzyl L-glutamate)聚合物膠束和甘草次酸修飾的殼聚糖/PEG納米粒等。結(jié)果顯示，該類載體材料具有顯著的肝靶向能力。因此以甘草次酸作為肝靶向介導(dǎo)基團(tuán)可以研宄開發(fā)一類新型的甘草次酸介導(dǎo)的肝靶向納米給藥系統(tǒng)。中國專利CN101254308A公開了一種甘草次酸-聚乙二醇/殼聚糖肝靶向復(fù)合給藥系統(tǒng)及制備方法，并說明該靶向給藥系統(tǒng)對(duì)肝癌細(xì)胞有很強(qiáng)的結(jié)合能力；中國專利CN101642573A公開了一種殼聚糖基肝靶向納米粒子給藥系統(tǒng)及其制備方法，將甘草次酸作為靶標(biāo)分子的同時(shí)作為疏水基團(tuán)偶聯(lián)在硫酸酯殼聚糖或羧甲基殼聚糖上，從而構(gòu)建形成肝靶向納米給藥系統(tǒng)；中國專利CN102336802A公開了甘草次酸修飾脂質(zhì)、肝靶向脂質(zhì)體、膠束及復(fù)合物和制法，將甘草次酸與磷脂或膽固醇在縮合劑條件下制得甘草次酸修飾的脂質(zhì)，并以其為基本材料制備了甘草次酸介導(dǎo)的肝靶向脂質(zhì)體和膠束載體。由此可見，甘草次酸作為靶向基團(tuán)運(yùn)用于肝靶向給藥系統(tǒng)構(gòu)建已經(jīng)受到廣大學(xué)者關(guān)注。
[0005]肝素主要是從牛肺或豬小腸粘膜中提取出來的一種動(dòng)物粘多糖硫酸酯，因最初在肝臟中發(fā)現(xiàn)而得名。肝素主要是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等結(jié)構(gòu)單元組成的水溶性長鏈大分子，平均分子量在12000Da左右。肝素因其與抗凝血酶獨(dú)特的結(jié)合能力早在1939年便已作為血液抗凝劑用于臨床研宄。不過，肝素的臨床應(yīng)用也易引發(fā)諸如出血、血小板減少癥的出現(xiàn)，從而限制了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。低分子肝素是普通肝素的降解產(chǎn)物。與普通肝素相比，低分子肝素在具有相似或者更優(yōu)的抗凝血、抗炎、抗血管增生以及抗腫瘤特性的同時(shí)，其可能的不良反應(yīng)顯著降低。因此，低分子肝素用于相關(guān)疾病治療更加安全可靠。低分子肝素因分子量小，骨架剛性降低而具有更加優(yōu)良的水溶性。此外，肝素骨架中含有大量活潑的可修飾的游離基團(tuán)，能夠通過化學(xué)修飾賦予其新的性能。因此肝素在除用作抗凝活性成分之外，以水溶性低分子肝素為基本骨架構(gòu)架納米給藥系統(tǒng)吸引了眾多藥物制劑研宄工作者的關(guān)注。
[0006]近年來，對(duì)低分子肝素骨架進(jìn)行疏水改性并在水性介質(zhì)中構(gòu)建聚合物膠束吸引了眾多醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的研宄興趣。通過化學(xué)手段將疏水性小分子引入肝素骨架中從而構(gòu)建兩親性聚合物并誘使其在水性介質(zhì)中發(fā)生自組裝聚合成為具有疏水內(nèi)核的核殼結(jié)構(gòu)膠束。但是通常情況下這些納米膠束系統(tǒng)并不具備從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)逃逸的能力，在體內(nèi)很容易被單核巨噬細(xì)胞吞噬而清除。另一方面，這種依靠制劑納米級(jí)粒徑實(shí)現(xiàn)的被動(dòng)靶向依然存在腫瘤部位自聚物攝取不充分、甚至引發(fā)多藥耐藥從而降低療效的現(xiàn)象。為了完成腫瘤納米系統(tǒng)的靶向給藥，利用體內(nèi)的特異性分子識(shí)別機(jī)制，在納米載體構(gòu)建過程中偶聯(lián)靶標(biāo)分子已成為一種較為成熟的革E向策略。
[0007]綜上所述，以低分子肝素作為水溶性骨架材料構(gòu)建聚合物膠束，在低分子肝素分子上引入甘草次酸進(jìn)行疏水改性，使其具備在水性溶液中自組裝聚集的性能并利用其與肝癌實(shí)質(zhì)細(xì)胞的特異性結(jié)合能力實(shí)現(xiàn)納米膠束的肝靶向藥物遞送。該設(shè)計(jì)方法在增加藥物溶解度，改變藥物在體內(nèi)的分布，延長藥物在體內(nèi)滯留時(shí)間的同時(shí)，并發(fā)揮甘草次酸修飾材料的靶向性能，其設(shè)計(jì)方法在腫瘤診斷和治療中具有很大的研宄開發(fā)前景。目前該設(shè)計(jì)尚未見相關(guān)報(bào)道。此外，運(yùn)用抗癌藥物增敏劑同一線抗腫瘤藥物進(jìn)行聯(lián)合用藥，逆轉(zhuǎn)單一長期用藥導(dǎo)致的多藥耐藥作用，增強(qiáng)抗腫瘤藥物的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種低分子肝素-甘草次酸聚合物，并提供了其合成方法，以及其作為生物可降解性材料用于制備抗腫瘤藥物肝靶向納米制劑的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0010]低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成方法，包括步驟如下:
[0011](I)低分子肝素-己二酸二酰肼的合成:將低分子肝素溶解于蒸餾水中，向其中依次加入己二酸二酰肼、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、1-羥基苯并三氮唑，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應(yīng)體系PH = 6-7，室溫反應(yīng)20-30小時(shí)，得低分子肝素-己二酸二酰肼；
[0012](2)甘草次酸丁二酸酯的合成:將甘草次酸溶于無水四氫呋喃中，加入丁二酸酐和4- 二甲氨基吡啶，避光室溫下攪拌20-30小時(shí)后，旋蒸除去有機(jī)溶劑，然后加入乙酸乙酯溶解，洗滌、純化得到甘草次酸丁二酸酯；
[0013](3)甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液的制備:將甘草次酸丁二酸酯溶解于N，N 二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，于室溫?cái)嚢?-5小時(shí)后，加入有機(jī)堿，得到甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液；
[0014](4)低分子肝素-甘草次酸聚合物的合成:將步驟⑴中所得的低分子肝素-己二酸二酰肼溶于蒸餾水中，攪拌使其充分溶脹、溶解，然后加入N，N 二甲基甲酰胺稀釋，備用；將步驟(3)中所得甘草次酸丁二酸酯活性酯溶液在強(qiáng)烈攪拌下滴入上述低分子肝素-己二酸二酰肼溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)40-50小時(shí)，得到反應(yīng)物溶液，反應(yīng)溶液純化、冷凍干燥即得低分子肝素-甘草次酸聚合物。
[0015]上述合成方法中，步驟(I)中所述低分子肝素、蒸餾水、己二酸二酰肼、1-