用于識(shí)別相對(duì)于其野生型具有提高的特定代謝物細(xì)胞內(nèi)濃度的細(xì)胞的方法,其中通過(guò)重...的制作方法【專利說(shuō)明】用于識(shí)別相對(duì)于其野生型具有提高的特定代謝物細(xì)胞內(nèi)濃度的細(xì)胞的方法，其中通過(guò)重組工程實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的改變，以及用于制備相對(duì)于其野生型具有優(yōu)化的特定代謝物產(chǎn)量的經(jīng)基因修飾的生產(chǎn)細(xì)胞的方法，用于制備這種代謝物的方法，以及適合于此的核酸[0001]本發(fā)明涉及用于識(shí)別相對(duì)于其野生型具有提高的特定代謝物細(xì)胞內(nèi)濃度的細(xì)胞的方法，其中通過(guò)重組工程實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的改變，以及用于制備相對(duì)于其野生型具有優(yōu)化的特定代謝物產(chǎn)量的經(jīng)基因修飾的生產(chǎn)細(xì)胞的方法，用于制備這種代謝物的方法，以及適合于此的核酸。[0002]幾十年來(lái)，微生物在工業(yè)上被用于生產(chǎn)低分子量分子。低分子量分子是例如天然細(xì)菌代謝物如氨基酸（EP1070132Bl，WO2008/006680A8)、核苷和核苷酸（EP2097512Cl，CA2297613Cl)、脂肪酸（TO2009/071878Cl，TO2011/064393Cl)、維生素（EP0668359Cl)、有機(jī)酸（EP0450491Bl，EP0366922BI)或糖（EP0861902C1，US3642575A)。通過(guò)細(xì)菌生產(chǎn)的低分子量分子也是通過(guò)例如源自植物的異源基因的表達(dá)形成的那些分子。它們是植物活性物質(zhì)。實(shí)例包括紫杉醇（W01996/032490Cl，WO1993/021338Cl)、青蒿素（W02009/088404Cl)和屬于類異戊二烯、苯丙素類或生物堿類類別的另外的分子（MarienhagenJ，BottM，2012，JBiotechnol.，doi.org/10.1016/j.jbiotec.2012.06.001)。通常，除植物來(lái)源的分子或分子的前體而外也可用微生物制得這些具有經(jīng)濟(jì)利益的分子。這些包括例如用于制備甲基丙烯酸酯的羥基異丁酸(PCT/EP2007/055394)、用于制備塑料的二胺（JP2009-284905A)或用作燃料的醇（W02011/069105C2,WO2008/137406Cl)。[0003]適合用作生產(chǎn)低分子量分子的微生物是革蘭氏陰性的細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性的細(xì)菌和酵母菌。合適的細(xì)菌例如是屬于腸桿菌屬（GenusEnterobacteria)的埃希氏桿菌各種（Escherichiaspecies)如大腸桿菌，或?qū)儆诤癖诰鷮伲℅enusFirmicutes)的芽抱桿菌各種（Bacillusspecies)如枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)，或?qū)儆诤癖诰鷮俚娜榍蚓鞣N（Lactococcusspecies)如乳酸乳球菌（LactococcusIactis)或乳桿菌各種（Lactobacillusspecies)如干酷乳桿菌（Lactobacilluscasei)，或?qū)儆谧幽揖鷮伲℅enusAscomycetes)的酵母屬各種（Saccharomycesspecies)如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或耶氏酵母屬各種（Yarrowiaspecies)如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，或?qū)儆诎魻顥U菌屬（GenusCorynebacterium)的棒狀桿菌屬各種(Corynebacteriumspecies)。[0004]棒狀桿菌中優(yōu)選的是有效棒狀桿菌（Corynebacteriumefficiens)(DSM44549)、熱產(chǎn)氨棒狀桿菌（Corynebacteriumthermoaminogenes)(FERMBP-1539)和產(chǎn)氨棒狀桿菌（Corynebacteriumammoniagenes)(ATCC6871)，但特別是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)(ATCC13032)。谷氨酸棒狀桿菌的一些種是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)下的其它名稱已知的。例如嗜乙酰乙酸棒狀桿菌（Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、百合棒狀桿菌（Corynebacteriumlilium)DSM20137、棲糖蜜棒狀桿菌(Corynebacteriummelassecola)ATCC17965、黃色短桿菌（BrevibacteriumfIavum)ATCC14067、乳酸發(fā)酵短桿菌（Brevibacteriumlactofermentum)ATCC13869、散枝短桿菌(擴(kuò)展短桿菌）ATCC14020和嗜氨微桿菌（Microbacteriumammoniaphilum)ATCC15354〇[0005]為了形成和生產(chǎn)低分子量分子，表達(dá)或增強(qiáng)表達(dá)該低分子量分子的合成途徑的微生物本身的基因、或同源基因或異源基因，或提高其mRNA的穩(wěn)定性。為此，這些基因可以在質(zhì)?；蜉d體上引入到細(xì)胞中，或它們可以存在于附加體上，或整合到染色體中。細(xì)胞自身的染色體編碼的基因也可以在它們的表達(dá)中得以增加。這例如通過(guò)染色體中適當(dāng)?shù)耐蛔冊(cè)趩?dòng)子區(qū)域中實(shí)現(xiàn)。也可以將導(dǎo)致產(chǎn)量增加的其它突變引入到染色體中，所述其它突變例如影響mRNA的穩(wěn)定性，或滲透穩(wěn)定性，對(duì)pH值變化的耐受性，或者也可將其功能未知、但對(duì)產(chǎn)物的形成有有利影響的基因引入到染色體中。同源基因或異源基因也被嵌入到染色體中，或者它們被如此嵌入，以至于它們?cè)谌旧w中以多次復(fù)制存在。[0006]有針對(duì)性地將突變或基因嵌入到基因組中需要構(gòu)建質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過(guò)利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶在體外重組DNA序列來(lái)制備。為有針對(duì)性地引入染色體突變，整個(gè)過(guò)程還包括以下步驟：為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)置換，對(duì)成功置換的測(cè)試，和最后對(duì)增加的產(chǎn)物形成的測(cè)試。這需要在圖1(左）中示意性列出的多個(gè)步驟，Al-A8。這種方法適用于許多用于生產(chǎn)小分子的細(xì)菌。實(shí)例是谷氨酸棒狀桿菌（Smallmobilizablemulti-purposecloningvectorsderivedfromtheEscherichiacoliplasmidspK18andpK19:selectionofdefineddeletionsinthechromosomeofCorynebacteriumglutamicum.SchaferA，TauchA，JagerW?KalinowskiJ?ThierbachG?PlihlerA.Gene.1994Jul22;145(1):69-73)，或綠胺桿菌（Pseudomonasaeruginosa)(AllelicexchangeinPseudomonasaeruginosausingnovelColEl-typevectorsandafamilyofcassettescontainingaportableoriTandthecounter-selectableBacillussubtilissacBmarker.SchweizerHP.MolMicrobiol.1992May;6(9):1195_204)，或枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)(ConstructionofamodularplasmidfamilyforchromosomalintegrationinBacillussubtilis.GimpelM，BrantlS.JMicrobiol.Methods.201211月；91(2):312-7)，或肉毒梭菌屬（Clostridien)(Novelsystemforefficientisolationofclostridiumdouble-crossoverallelicexchangemutantsenablingmarkerIesschromosomalgenedeletionsandDNAintegration.Al-HinaiMA，F(xiàn)astAG，PapoutsakisET.Appl.EnvironMicrobiol.201211月；78(22):8112-21)〇[0007]有針對(duì)性地將突變或基因引入到染色體中需要體外重組DNA序列，利用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶以制備質(zhì)粒（圖1，A1)。為此所需的質(zhì)粒是在合適的條件下在所希望的生產(chǎn)者中不復(fù)制的質(zhì)粒。在通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒引入到微生物中，化學(xué)轉(zhuǎn)化或彈道轉(zhuǎn)化（ballistischeTransformation)(圖1，A2)之后，整合到染色體中。在整合中通過(guò)載體介導(dǎo)的抗性來(lái)選擇（圖1，A3)。合適的質(zhì)粒例如是pBRHl(W02003076452C2)或pWVOl(US6025190)，其在醋桿菌屬（Azetobacter)或芽抱桿菌屬（Bacillus)中在轉(zhuǎn)化（圖1，A2)后不再能夠通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)的溫度復(fù)制，由此在抗性細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)將載體嵌入到染色體中。質(zhì)粒pK19mobsacB從一開(kāi)始就不能在棒狀桿菌如谷氨酸棒桿菌中復(fù)制，因此，在卡那霉素存在下僅選擇克隆，其中，通過(guò)同源重組將載體整合到染色體中（Schafer等人，Gene145,69-73(1994)(圖1，A3)。這些非復(fù)制質(zhì)粒充當(dāng)載體，以使所針對(duì)的染色體中的基因突變、使啟動(dòng)子序列突變、刪除序列、或置換序列、或者將新的基因引入到染色體中。該方法是復(fù)雜的，因?yàn)楸仨殕为?dú)在體外構(gòu)建質(zhì)粒。該方法此外是復(fù)雜的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)合適的選擇方法，如選擇抗生素抗性或所提出的溫度升高，首先使質(zhì)粒與要置換的序列一起引入到染色體中，并在隨后的步驟中再?gòu)娜旧w中失去該質(zhì)粒（圖，A4)。通過(guò)隨后的測(cè)試，通常為PCR擴(kuò)增，然后可以首先檢驗(yàn)要置換的序列是否如希望般確實(shí)保留在染色體中（圖1，A5)。由此構(gòu)建了單個(gè)克隆，隨后培養(yǎng)它（圖1，A6)，定量其產(chǎn)物（圖1，A7)，并且由此可能得到改進(jìn)的生產(chǎn)者（圖1，A8)。這種質(zhì)粒構(gòu)建和同源重組以獲得微生物生產(chǎn)者的技術(shù)被廣泛應(yīng)用，例如以在谷氨酸棒桿菌或大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)等位基因置換或缺失（US8,293,514;US8,257,943;US8,216,820;WO2008/006680A8;EP2386650Cl)〇[0008]近來(lái)，引入所謂的"重組工程"作為有針對(duì)性的基因組突變的另一方法。引入突變需要遠(yuǎn)比借助質(zhì)粒嵌入突變更少的步驟（圖1，右，BI-B2)。重組工程利用噬菌體-或原噬菌體基因，它們導(dǎo)致染色體DNA和外部供入的DNA之間的同源重組。在最簡(jiǎn)單的情況中，這種DNA作為商業(yè)合成的單鏈-DNA來(lái)使用。也可以使用借助PCR擴(kuò)增的雙鏈DNA。如果存在合適的噬菌體-或原噬菌體基因，這種方法僅需要很少步驟。但是，缺點(diǎn)是，這種方法基本上被限于引入允許在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的突變，例如引入抗生素抗性，因?yàn)槠渌蛔儾荒鼙蛔R(shí)別。因此，形成產(chǎn)物的微生物的快速生成的直接使用是非常有限的，并且迄今僅被描述用于大腸桿菌和產(chǎn)物番前紅素（Programmingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolution.WangHH，IsaacsFJ,CarrPA,SunTL,XuG,ForestCR，ChurchGM.Nature.2009;460(7257):894-8)。在這種特殊情況下，由于著色的番茄紅素，可借助菌落顏色推斷出產(chǎn)物的形成。對(duì)于其它生物體和其它產(chǎn)物，例如氨基酸或其它有機(jī)酸，迄今不能直接識(shí)別產(chǎn)品形成的增加。另一個(gè)缺點(diǎn)是，重組工程限于大腸桿菌和非常有限數(shù)量的另外的微生物，如腸道沙門(mén)氏菌（Salmonellaenterica)，假結(jié)核耶爾森菌（Yersiniapseudotuberculosis)，乳芽抱桿菌屬（Lactobacillus)，枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)和分枝桿菌（Mycobacterium)。[0009]另一問(wèn)題在于，迄今沒(méi)有任何通用系統(tǒng)，用以在重組工程后立即在大的細(xì)胞群中識(shí)別并從這樣的細(xì)胞群中分離出形成產(chǎn)物的微生物。迄今在重組工程中使用的在培養(yǎng)皿上選擇的方法，如已述及的，限于非常特殊的應(yīng)用和此外在培養(yǎng)皿上得到的重組體的數(shù)目有限，這使得該方法不適用于大的重組體庫(kù)（Rekombinantenbibliotheken)的篩選。[0010]重組工程基于由源自噬菌體或原噬菌體的蛋白介導(dǎo)的同源重組。對(duì)于大腸桿菌而言，已知兩個(gè)同源系統(tǒng)。Rac-原菌體的RecE/RecT和由菌體A的Red-y、Red-0和Red-a構(gòu)成的red-操縱子。這兩個(gè)系統(tǒng)都允許在兩個(gè)不同的DNA分子之間的可自由選擇的DNA片段的置換。DNA的置換通過(guò)在目標(biāo)片段側(cè)翼的兩個(gè)具有30-100個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的同源(相似或相同的）區(qū)域進(jìn)行。為引入染色體突變，將攜帶突變的DNA分子商業(yè)合成為單鏈（圖1，B1)，并引入到表達(dá)蛋白質(zhì)Red-0的大腸桿菌中。由于所引入的DNA分子和該染色體之間的同源性，通過(guò)Red-0蛋白介導(dǎo)重組和序列的置換。以此方式修正在大腸桿菌的染色體的galK基因中的突變。因?yàn)橹挥型旰玫膅alK基因能夠利用半乳糖，所以選擇在培養(yǎng)皿上通過(guò)生長(zhǎng)成為菌落的重組體克?。▓D1，B2)(Rekombineering:invivogeneticengineeringinE.coli,S.enterica，和beyond.SawitzkeJA，ThomasonLC,CostantinoN，BubunenkoM，DattaS，CourtDL.MethodsEnzymol當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4 5