用于檢測(cè)除草劑耐受性玉米植物dbn9878的核酸序列及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)除草劑耐受性玉米植物DBN9878的核酸序列及其檢測(cè) 方法，特別是涉及一種耐受草甘膦和草銨膦的玉米植物DBN9878和檢測(cè)生物樣品中是否包 含特定轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9878的DNA分子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]N-膦酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦，是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型慢性廣譜滅生性除草劑。草 甘膦是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS)的合成底物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP) 的競爭性抑制劑，可抑制PEP和3-磷酸莽草酸這兩種底物在EPSPS催化下向5-烯醇丙酮 酰莽草酸-3-磷酸莽草酸的轉(zhuǎn)化，從而阻斷芳香族氨基酸合成前體-莽草酸的合成途徑，使 蛋白質(zhì)的合成受到干擾導(dǎo)致植物和細(xì)菌死亡。
[0003] 草甘膦耐受性可以通過表達(dá)修飾的EPSPS來實(shí)現(xiàn)。修飾的EPSPS對(duì)草甘膦具有更 低的親和性，因而在草甘膦存在的情況下，EPSPS保持了它們的催化活性，即獲得了草甘膦 耐受性。
[0004] 玉米（ZeamaysL.)在世界上很多地區(qū)都是主要的糧食作物。在玉米生產(chǎn)中除草 劑耐受性是一項(xiàng)重要的農(nóng)藝性狀，特別是對(duì)草甘膦除草劑的耐受性。玉米對(duì)草甘膦除草劑 的耐受性可以通過轉(zhuǎn)基因的方法使草甘膦除草劑耐受型基因（EPSPS，CP4)在玉米植物中 表達(dá)而獲得，例如玉米事件NK603、玉米事件M0N88017等。
[0005] 草甘膦耐受性耕種系統(tǒng)的普遍采用和草甘膦使用的日益增加已經(jīng)導(dǎo)致近年來草 甘膦抗性雜草的流行。在種植者面對(duì)草甘膦抗性雜草或向更難以控制的雜草物種轉(zhuǎn)變的地 區(qū)，種植者可以通過與能夠控制遺漏雜草的其它除草劑混合或交替使用來補(bǔ)償草甘膦的弱 點(diǎn)。
[0006] 草銨膦是膦絲菌素類除草劑中的一種非系統(tǒng)性、非選擇性除草劑。主要用于一年 生或多年生闊葉雜草的出土后控制，是通過L-膦絲菌素（草銨膦中的活性成分）對(duì)谷氨酰 胺合酶（一種對(duì)于植物中的氨解毒必需的酶）的不可逆抑制來控制雜草的。與草甘膦殺根 不同，草銨膦先殺葉，通過植物蒸騰作用可以在植物木質(zhì)部進(jìn)行傳導(dǎo)，其速效性間于百草枯 和草甘膦之間。
[0007] 從鏈霉菌分離的酶膦絲菌素N-乙?；D(zhuǎn)移酶（PAT)通過乙?；呋疞-膦絲菌素 轉(zhuǎn)化為其無活性形式。表達(dá)PAT的植物優(yōu)化形式的基因已經(jīng)在大豆中使用以賦予大豆對(duì) 草銨膦除草劑的耐受性，例如大豆事件A5547-127。因此與草銨膦耐受性性狀組合使用草銨 膦除草劑可以作為一種有效管理草甘膦抗性雜草的非選擇性手段。
[0008] 同時(shí)，隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米大面積種植，少量存活下來的昆蟲/害蟲經(jīng)過幾代繁 殖后，可能產(chǎn)生抗性?？钩輨┺D(zhuǎn)基因玉米作為非抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米，與轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米以一 定比例一并種植，可以延緩昆蟲/害蟲產(chǎn)生抗藥性。
[0009] 已知外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)受到它們的染色體位置的影響，可能是由于染色 質(zhì)結(jié)構(gòu)（如異染色質(zhì)）或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件（如增強(qiáng)子）接近整合位點(diǎn)。為此，通常需要篩選大 量的事件才有可能鑒定出可以商業(yè)化的事件（即導(dǎo)入的目標(biāo)基因得到最優(yōu)表達(dá)的事件）。 例如，在植物和其他生物體中已經(jīng)觀察到導(dǎo)入基因的表達(dá)量在事件間可能有很大差異；在 表達(dá)的空間或時(shí)間模式上可能也存在差異，如在不同植物組織之間轉(zhuǎn)基因的相對(duì)表達(dá)存在 差異，這種差異表現(xiàn)在實(shí)際的表達(dá)模式可能與根據(jù)導(dǎo)入的基因構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件所 預(yù)期的表達(dá)模式不一致。因此，通常需要產(chǎn)生成百上千個(gè)不同的事件并從這些事件中篩選 出具有以商業(yè)化為目的所預(yù)期的轉(zhuǎn)基因表達(dá)量和表達(dá)模式的單一事件。具有預(yù)期的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)量和表達(dá)模式的事件可用于采用常規(guī)育種方法通過有性異型雜交將轉(zhuǎn)基因滲入到其 他遺傳背景中。通過這種雜交方式產(chǎn)生的后代保持了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。應(yīng)用 這種策略模式可以確保在許多品種中具有可靠的基因表達(dá)，而這些品種能很好的適應(yīng)當(dāng)?shù)?的生長條件。
[0010] 能夠檢測(cè)特定事件的存在以確定有性雜交的后代是否包含目的基因?qū)⑹怯幸娴摹?此外，檢測(cè)特定事件的方法還將有助于遵守相關(guān)法規(guī)，例如來源于重組農(nóng)作物的食物在投 入市場(chǎng)前需要獲得正式批準(zhǔn)和進(jìn)行標(biāo)記。通過任何熟知的多核苷酸檢測(cè)方法來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因 的存在都是可能的，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)或利用多核苷酸探針的DNA雜交。這些檢 測(cè)方法通常集中于常用的遺傳元件，例如啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等。因此，除非與插入的 轉(zhuǎn)基因DNA相鄰的染色體DNA( "側(cè)翼DNA"）的序列是己知的，上述這種方法就不能夠用于 區(qū)別不同的事件，特別是那些用相同的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的事件。所以，目前常利用跨越了插 入的轉(zhuǎn)基因和側(cè)翼DNA的接合部位的一對(duì)引物通過PCR來鑒定轉(zhuǎn)基因特定事件，具體地說 是包含側(cè)翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)除草劑耐受性玉米植物DBN9878的核酸序列 及其檢測(cè)方法，轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9878對(duì)草甘膦除草劑和草銨膦除草劑具有較好的耐受 性，且檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確快速的鑒定生物樣品中是否包含特定轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9878的 DNA分子。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種核酸序列，包括SEQIDNO:3或其互補(bǔ)序列中 至少11個(gè)連續(xù)的核苷酸、和/或SEQIDNO:4或其互補(bǔ)序列中至少11個(gè)連續(xù)的核苷酸。
[0013] 優(yōu)選地，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 1或其互補(bǔ)序列、和/或SEQ ID NO: 2或其 互補(bǔ)序列。
[0014] 進(jìn)一步地，所述核酸序列包括SEQIDN0:3或其互補(bǔ)序列、和/或SEQIDN0:4或 其互補(bǔ)序列。
[0015] 更進(jìn)一步地，所述核酸序列包括SEQID NO:5或其互補(bǔ)序列。
[0016] 所述SEQIDNO: 1或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9878中在插入序列的5' 末端位于插入接合部位附近的一個(gè)長度為22個(gè)核苷酸的序列，所述SEQIDN0:1或其互補(bǔ) 序列跨越了玉米插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組DNA序列和插入序列的5'末端的DNA序列，包含所 述SEQIDN0:1或其互補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9878的存在。所述SEQID N0:2或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9878中在插入序列的3'末端位于插入接合部位 附近的一個(gè)長度為22個(gè)核苷酸的序列，所述SEQIDN0:2或其互補(bǔ)序列跨越了插入序列的 3'末端的DNA序列和玉米插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組DNA序列，包含所述SEQIDNO: 2或其互 補(bǔ)序列即可鑒定為轉(zhuǎn)基因玉米事件DBN9878的存在。
[0017] 本發(fā)明中，所述核酸序列可以為所述SEQIDN0:3或其互補(bǔ)序列中轉(zhuǎn)基因插入序 列的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù)多核苷酸（第一核酸序列），或者為所述SEQID NO: 3或其互補(bǔ)序列中5'側(cè)翼玉米基因組DNA區(qū)域的任何部分的至少11個(gè)或更多個(gè)連續(xù) 多核苷酸（第二核酸序列）。所述核酸序列進(jìn)一步可以為同源于或互補(bǔ)于包含完整的所述 SEQIDNO: 1的所述SEQIDN0:3的一部分。當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄泻偷诙怂嵝蛄幸黄鹗褂脮r(shí)， 這些核酸序列在產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA擴(kuò)增方法中包括DNA引物組。使用DNA引物對(duì)在DNA 擴(kuò)增方法中產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物是包括SEQIDNO: 1的擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，可以診斷轉(zhuǎn)基因玉米事件 DBN9878或其后代的存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，第一和第二核酸序列不必僅僅由DNA組 成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作為一種或多種聚合酶模板 的核苷酸或其類似物的組合。此外，本發(fā)明中所述探針或引物應(yīng)該是至少大約11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21或22個(gè)連續(xù)核苷酸的長度，其可以選自5￡〇10勵(lì)：1、5￡〇10 N0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4 和SEQIDN0:5 中所述的核苷酸。當(dāng)選自SEQIDN0:3、 SEQIDN0:4和SEQIDN0:5所示的核苷酸時(shí)，所述探針和引物可以為長度是至少大約21 個(gè)到大約50個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸。所述SEQIDN0:3或其互補(bǔ)序列為轉(zhuǎn)基因玉米事件 DBN9878中在插入序列的5'末端位于插入接合部位附近的一個(gè)長度為1411個(gè)核苷酸的序 列，所述SEQIDNO: 3或其互補(bǔ)序列由1120個(gè)核苷酸的玉米側(cè)翼基因組DNA序列（SEQID NO: