一種雙特異性抗體cd133×cd3的構建及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及免疫學的技術領域。具體地說，設及雙特異性抗體的構建和制備方法。
【背景技術】
[0002] 雙特異性抗體化ispecificantibody,BiAb)是含有兩種特異性抗原結合位點的 人工抗體，能在祀細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，產(chǎn)生導向性的效應功能。BiAb 在生物醫(yī)學中，特別是在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景。通過BiAb介導細胞毒作 用殺死腫瘤細胞是當前免疫治療應用研究的熱點，其主要特點是BiAb能同時結合腫瘤相 關抗原和免疫效應細胞上的祀分子，直接觸發(fā)免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。然 而，在雙特異性抗體藥物研發(fā)過程中，普遍存在著表達困難、產(chǎn)量低、純化難、穩(wěn)定性差等諸 多障礙，因此，構建新的雙特異性抗體，使其能克服上述障礙，并建立相應的免疫殺傷動物 模型，是非常有必要的。本發(fā)明提供了一種新型雙特性抗體的構建，并描述了對其藥效學的 研究方法及結果。W下是針對所研究的免疫細胞抗原和腫瘤細胞抗原，W及相關技術發(fā)展 的一些【背景技術】介紹。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4個亞基組成；5、e、丫、C，其分子質量分別為18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其長度分別有171、207、182、164個氨基酸殘基。它們一起組成6條膚 鏈，常與T細胞受體（Tcellrec巧tor,TCR)緊密結合形成含有8條膚鏈的TCR-CD3復合 體，結構示意圖見圖1。此復合體具有T細胞活化信號轉導，穩(wěn)定TCR結構的功能。CD3胞 質段含免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif, 口AM),TCR識別并結合由血1〔(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原膚， 導致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸殘基被T細胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶p561ck磯酸化， 然后可募集其他含有S肥(Scrhomology2)結構域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM 的磯酸化和與ZAP-70的結合是T細胞活化信號傳導過程早期階段的重要生化反應之一。因 此，CD3分子的功能是轉導TCR識別抗原所產(chǎn)生的活化信號。
[000引 2.CD133
[0006] CD133是跨膜糖蛋白，分子量為120kDa，具有5個跨膜區(qū)，曾命名為AC133。 2000年，在英國Harrogate舉行的第7屆人類白細胞分化抗原國際工作會議（7th InternationalWorkshoponHumanLeucocyteDifferentiationAntigens，HLDA7)上被 正式命名為CD133。單克隆抗體AC133直接與CD133糖基化抗原表位結合，可用于從外周 血、骨髓、廝帶血及其它組織中分析和分選CD133陽性（CD133+)細胞。CD133最初被認為是 造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞的標志物，其研究始于20世紀60年代。后來，CD133被證實其作 為一種干細胞標記物，在肺癌化imCF,JacksonELWoolfendenAE,etal.Identification ofbronchioalveolarstemcellsinnormallungandlungcancer. [J]. Cell.2005，12U6):823-835.)、結腸癌（O'BrienCA，PollettA，GallingerS，etal.A humancoloncancercellcapableofinitiatingtumourgrowthinimmunodeficient mice.[。.化1：11'6.2007,445(7123):106-110.)、膜腺癌（OlempskaM,Eisenach PA,Ammerpohl0,etal.Detectionoftumorstemcellmarkersinpancreatic carcinomacelllines[J].HepatobiliaryPancreatDisInt, 2007, 6(1):92-97.)、 腦月中瘤(SinghSK,HawkinsC,ClarkeID,etal.Identificationofhumanbrain tumourinitiatingcells. [jLl^Jature.2004,432(7015):396-401.)、B16 黑色素 瘤(MonzaniE,FacchettiF,GalmozziE,etal.MelanomacontainsCD133and ABCG2positivecellswithenhancedtumourigenicpotential. [J].EurJ Cancer. 2007, 43(5) :935-946.)和前列腺癌（CollinsAT，BeiryPA,HydeC，et al.Prospectiveidentificationoftumorigenicprostatecancerstemcells. [J]. CancerRes.2005,65(23):10946-10951.)等干細胞中均有表達并行使作用。在腦腫瘤 中，Singh等(SinghSK,HawkinsC,ClarkeID,etal.Identificationofhuman braintumourinitiatingcells. [jL^^re. 2004, 432(7015) :396-401.)證實CD133+ 細胞有顯著的增殖能力、自我更新能力和分化能力，將少至100個CD133+細胞接種 到N0D/SCID小鼠腦組織就能形成腫瘤，傳代后能夠連續(xù)接種，而且在N0D/SCID小鼠 組織中形成腫瘤與患者原發(fā)腫瘤表型相同；而CD133-細胞多達1X105個細胞仍不能形 成腫瘤。O'Brien等（O'BrienCA,PollettA,GallingerS,etal.Ahumancolon cancercellcapableofinitiatingtumourgrowthinimmunodeficientmice. [J]. 化Uire. 2007, 445 (7123) : 106-110.)將結腸癌組織中的CD133陽性細胞移植到N孤/ SCID小鼠腎被膜下，發(fā)現(xiàn)所有結腸癌循環(huán)免疫復合物（CIC)都是CD133陽性細胞，而那 些CD133 陰性細胞沒有致瘤性。Olempska等（OlempskaM,EisenachPA,Amme巧ohl0,et al.Detectionoftumorstemcellmarkersinpancreaticcarcinomacelllines[J]. HepatobiliaryPancreatDisInt, 2007, 6(1) :92-97.)發(fā)現(xiàn)，在膜腺癌的 5 個細胞系中的 兩株表達CD133和ABCG2上調，暗示著CD133可能是膜腺癌干細胞的特異表面分子；隨后， 化rmann等（2007)也證實了膜腺癌組織中存在表達CD133的腫瘤干細胞群，并且該群細胞 具有更強的致瘤性。
[0007] 3.雙特異性抗體技術發(fā)展
[000引雙特異性抗體，一個抗體分子中的兩個抗原結合部位可分別結合兩種不同的抗原 表位的抗體。
[0009] 抗體藥物是W細胞工程技術和基因工程技術為主體的抗體工程技術制備的生物 大分子藥物，具有特異性高、性質均一、可針對特定祀點定向制備等優(yōu)點。單克隆抗體在臨 床上主要應用于W下=個方面：腫瘤治療、免疫性疾病治療W及抗感染治療。其中腫瘤的治 療是目前單抗應用最為廣泛的領域，目前已經(jīng)進入臨床試驗和上市的單抗產(chǎn)品中，用于腫 瘤治療的產(chǎn)品數(shù)量占比大概為50%。單克隆抗體治療腫瘤是通過其對病變細胞特異祀點相 結合，從而刺激免疫系統(tǒng)來殺傷祀細胞的免疫療法，為了增強抗體的效應功能，特別是殺傷 腫瘤細胞的效果，人們嘗試多種方法改造抗體分子，雙特異性抗體是改