亞洲玉米螟中腸apn啟動(dòng)子及活性分析的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一段DNA序列，它可以作為啟動(dòng)子調(diào)控基因的 表達(dá)。具體涉及一種來(lái)源于亞洲玉米螟氨肽酶基因APN(GenebankNO.EU137839)，并在細(xì) 胞中高度表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞洲玉米螟是我國(guó)玉米的重要害蟲(chóng)，亦是Bt玉米的重要靶標(biāo)昆蟲(chóng)。Bt毒素與昆蟲(chóng) 中腸上皮細(xì)胞受體的結(jié)合是決定其殺蟲(chóng)毒力的關(guān)鍵，受體的變異與昆蟲(chóng)對(duì)Bt毒素產(chǎn)生抗 性相關(guān)。眾所周知，鱗翅目昆蟲(chóng)中氨肽酶（aminopeptidase，APN))是蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng) 蛋白Cry的作用靶標(biāo)之一。這些酶蛋白家族至少有八個(gè)不同的成員同時(shí)在鱗翅目幼蟲(chóng)中腸 的表達(dá)。鱗翅目昆蟲(chóng)中腸刷狀緣膜上氨肽酶是Bt毒素的主要受體蛋白。APN屬于鋅金屬肽 酶，N-末端具有剪切信號(hào)肽、C-末端含有一個(gè)糖基化磷脂肌醇（GPI)錨信號(hào)序列、鋅結(jié)合位 點(diǎn)HEXXH、谷氨酸鋅化氨肽酶的保守結(jié)構(gòu)GAMEN。鱗翅目昆蟲(chóng)APN的保守結(jié)構(gòu)區(qū)如鋅結(jié)合位 點(diǎn)、GAMEN、毒素結(jié)合區(qū)等的氨基酸改變就可能引起其與毒素親和性的改變。已有研宄結(jié)果 表明，氨肽酶是Cry1A類(lèi)Bt蛋白的主要受體，它的變異可以導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)Bt產(chǎn)生抗性。亞洲 玉米螟氨肽酶APN氨基酸發(fā)生突變可能會(huì)引起該氨肽酶上毒素結(jié)合部位空間結(jié)構(gòu)的變化， 繼而影響受體與毒素的結(jié)合親和性，從而導(dǎo)致亞洲玉米螟對(duì)CrylAb產(chǎn)生抗性。這可能是亞 洲玉米螟對(duì)Bt產(chǎn)生耐受性的重要生理機(jī)能。亞洲玉米螟中腸中ANP豐度極高，顯示出亞洲 玉米螟氨肽酶APN基因啟動(dòng)子極可能具有較高活性，迄今為止，未有從亞洲玉米螟中分離 出的APN高活性啟動(dòng)子。因此，對(duì)于新的高活性的并具有組織特異性的亞洲玉米螟相關(guān)啟 動(dòng)子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作 的轉(zhuǎn)錄因子的研宄具有重要意義，也可為深入研宄害蟲(chóng)對(duì)Bt抗性機(jī)制及新型抗蟲(chóng)新品種 的研制奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列能夠誘 導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)，而且該啟動(dòng)子來(lái)源于亞洲玉米螟APN基因。
[0004] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子真 核表達(dá)載體，該載體指導(dǎo)高水平表達(dá)目的基因APN的啟動(dòng)子序列和5'非翻譯區(qū)。
[0005] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種所述真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，該載體的表達(dá)能 反映啟動(dòng)子活性的高低。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆了亞洲玉米螟APN基因的啟動(dòng)子區(qū)，并構(gòu)建了真核 表達(dá)載體，所述載體包含帶有APN基因的5'非翻譯區(qū)的上述啟動(dòng)子。隨后利用所述載體在 Sf9細(xì)胞中表達(dá)，并檢測(cè)到該啟動(dòng)子的高水平活性。
[0007] 本發(fā)明提供一種獲得的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列如SEQID NO: 1所示，其中SEQIDNO:1的-lbp至-913bp區(qū)（見(jiàn)序列表）為亞洲玉米螟APN啟動(dòng) 子DNA序列，在真核細(xì)胞中高表達(dá)，本發(fā)明所述的啟動(dòng)子高水平活性。
[0008] 獲得的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列源自玉米螟氨肽酶基因APN。
[0009] SEQIDNO: 1的+lbp至+102bp區(qū)（見(jiàn)序列表）為亞洲玉米螟蚜APN基因的5'非 翻譯區(qū)的DNA序列，本發(fā)明所述的亞洲玉米螟APN基因的5'非翻譯區(qū)能在Sf9細(xì)胞中，通 過(guò)增強(qiáng)目標(biāo)外源基因的翻譯效力，而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的高水平表達(dá)。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)另一個(gè)目的，本發(fā)明提供一種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，所述 真核細(xì)胞表達(dá)載體包含亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列。
[0011] 上述用于Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)染的真核表達(dá)載體，是指能夠在細(xì)胞中瞬時(shí)、高水平表達(dá)外 源基因的載體。例如PGL3載體、pGL4載體。
[0012] 一種用真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，所述真核細(xì)胞表達(dá)包含亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子 序列。
[0013] 關(guān)于本發(fā)明所述的用于真核細(xì)胞的表達(dá)載體（PGL3)、亞洲玉米螟APN基因的啟動(dòng) 子和5'非翻譯區(qū)，在表達(dá)載體中位于外源基因（Luc+)的前面。本發(fā)明提供通過(guò)插入本發(fā) 明所述的亞洲玉米螟APN基因的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)至含有Luc+報(bào)告基因的載體中而構(gòu) 建的pGL3-〇fAPN(-913/+202)。但是，所述Luc+報(bào)告基因是外源基因，并預(yù)期可以用任意其 它有用的外源基因來(lái)代替。
[0014] 本發(fā)明提供來(lái)自亞洲玉米螟APN的啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)，根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子和 5'非翻譯區(qū)，使得能夠在真核細(xì)胞中進(jìn)行高水平的表達(dá)。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：可用于真核基因的高效表達(dá)，還可應(yīng)用于獲得低豐度基 因研宄，使其獲得高水平、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于目的基因功能研宄具有積極意義。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為亞洲玉米螟基因組電泳圖
[0017] 圖 2 為GenomewalkerPCR電泳圖
[0018] 圖3為APN啟動(dòng)子連T載酶切鑒定電泳圖
[0019] 圖4為APN啟動(dòng)子連pGL3PCR鑒定電泳圖
[0020] 圖5為APN啟動(dòng)子連pGL3酶切鑒定電泳圖
[0021] 圖6為pGL3-0fAPN(-913/+202)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后啟動(dòng)子活性檢測(cè)示意圖 圖7為pGL3-0fAPN(-913/+202)表達(dá)載體示意圖
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖介紹具體實(shí)施步驟，將能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人員更清楚地理解如何實(shí) 施本發(fā)明。盡管已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是以下 描述的目的是示例性的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實(shí)施例1:亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子的克隆
[0024] 依據(jù)亞洲玉米螟氨肽酶基因APN的mRNA序列（GenbankNo.EU137839)設(shè)計(jì)染色 體步移引物GSP1 (5-ACCGTATGAGGTAITTCAGTATCTCCCAA-3)和GSP2 (5-CGTCAGCGAAGAITGTGT TTCTGTATG-3)。提取玉米螟基因組DNA(圖 1)，并用平切酶Afel、EcoRV-HF、PvuII、SmaI、 PmeI、StuI、BstZ17I進(jìn)行消化，純化DNA并連接接頭引物。按照設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并按照Genomewalker(Clontech)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)1%瓊 脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1115bp的條帶（圖2)，并進(jìn)行回收?；厥掌闻cpGEM-T 載體連接得到重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖3)，并測(cè)序。
[0025] 亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子（啟動(dòng)子序列包含相對(duì)于SEQIDNO: 1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 的-lbp至-913bp區(qū)的DNA核苷酸序列），在亞洲玉米螟APN的5'區(qū)序列中得到鑒定。
[0026] 在本發(fā)明帶功能元件標(biāo)記的啟動(dòng)子序列表中，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基用+1示出， ATG為箭頭所指的灰背景色部分。并用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站分析了啟動(dòng)子的核心元件。啟動(dòng)子 分析網(wǎng)站http: //www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html
[0027] 實(shí)施例2 :亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子表達(dá)載體pGL3-0fAPN(-913/+202)的構(gòu)建
[0028] 將在實(shí)施例1中所克隆的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)（見(jiàn)序列表）插 入到PGL3載體中，從而構(gòu)建pGL3-〇fAPN(-393/+268)載體。
[0029] 更具體地說(shuō)，是利用引物（5-ACGCGTCCITTGTCCAGCAGTGGACG-3， 5-CTCGAGCGTCAGCGAAGATTGTGTTTC-3)擴(kuò)增并將該啟動(dòng)子序列克隆到pGL3載體Mlul和 Xhol位點(diǎn)上，構(gòu)建成pGL3-0fAPN(-913/+202)，用于驅(qū)動(dòng)Luc+的表達(dá)，經(jīng)PCR鑒定（圖4) 和酶切鑒定（圖5)獲得啟動(dòng)子與載體的重組質(zhì)粒。
[0030] 實(shí)施例3 :鑒定本發(fā)明所述的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子的活性
[0031] Sf9 細(xì)胞接種于 24 孔板中（4X105cells/ 孔），用CellfectinII試劑 (Invitrogen;2yL/ 每孔）瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染pGL3-0fAPN(-913/+202)建體（2yg/ 孔）和對(duì)照 報(bào)告基因質(zhì)粒phRL-TK(Promega;0. 2yg/孔），48小時(shí)后，收獲細(xì)胞，將所得裂解物用于測(cè) 量螢光素酶活性（Promega)。如圖6所示，pGL3-0fAPN913/+202)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞具有很高熒光 素酶活性。
[0032] 實(shí)用性
[0033] 如上所述，本發(fā)明提供亞洲玉米螟APN基因啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)。
[0034] 本發(fā)明提供分別將亞洲玉米螟APN基因啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)插入至pGL3而獲得 的真核細(xì)胞表達(dá)載體。
[0035] 經(jīng)使用所述的真核細(xì)胞表達(dá)載體進(jìn)行鑒定，本發(fā)明所述的亞洲玉米螟APN基因啟 動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明可用于提高真核基因的高效表 達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研宄使其獲得高水平、穩(wěn)定表達(dá)。
[0036] SEQIDNO. 1的序列（帶功能元件標(biāo)記）
[0037] (i)序列特征：(A)長(zhǎng)度：_lbp至 _913bp;+lbp至 +202bp; (B)類(lèi)型：核苷酸；（C) 鏈性：?jiǎn)捂湣?br>[0038] (ii)分子類(lèi)型：核苷酸
[0039](iii)序列描述：SEQIDNO. 1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種獲得的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列，其特征在于所述啟動(dòng)子序列如SEQID NO: 1所示，其中SEQIDNO:1的-Ibp至-913bp區(qū)為亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子DNA序列，SEQ IDNO: 1的+Ibp至+102bp區(qū)為亞洲玉米螟APN基因的5'非翻譯區(qū)的DNA序列。
2. -種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，其特征在于所述真核細(xì)胞表達(dá)載體包含 權(quán)利要求1所述的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列。
【專(zhuān)利摘要】亞洲玉米螟中腸APN啟動(dòng)子及活性分析。亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子及活性分析屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種獲得的亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO:1所示，其中SEQ ID NO：1的-1bp至-913bp區(qū)為丁布誘導(dǎo)型玉米螟OfCYP啟動(dòng)子DNA序列，SEQ ID NO:1的+1bp至+102bp區(qū)為亞洲玉米螟氨肽酶基因APN的5’非翻譯區(qū)的DNA序列；一種用于細(xì)胞系轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞表達(dá)載體，所述真核細(xì)胞表達(dá)載體包含亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列；一種用真核細(xì)胞表達(dá)載體的表達(dá)，所述真核細(xì)胞表達(dá)包含亞洲玉米螟APN啟動(dòng)子序列；本發(fā)明可用于真核基因的高效表達(dá)，應(yīng)用于獲得低豐度基因研究，使其獲得高水平、穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)于目的功能研究具有積極意義。
【IPC分類(lèi)】C12N15-79, C12N15-113
【公開(kāi)號(hào)】CN104818275
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510184118
【發(fā)明人】尚慶利, 潘怡歐, 畢銳, 楊晨, 彭天飛
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月5日
【申請(qǐng)日】2015年4月18日