一種高純度那屈肝素鈣的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及肝素類藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種純度高、分子量分布范圍窄的那 屈肝素鈣。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝素是從哺乳動(dòng)物組織（如小腸粘膜、肺、肝臟）中提取的一種硫酸化的糖胺聚糖 類化合物，從發(fā)現(xiàn)至今已有近百年歷史，其分子量從3KD-30KD不等，分子結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，較 長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)無(wú)法人工合成，并且目前只有來(lái)源于豬小腸粘膜的肝素能用于臨床治療。
[0003] 肝素系列藥物主要用于預(yù)防和治療深部靜脈血栓和血液透析抗凝、手術(shù)后抗凝 等，也用于急性冠狀動(dòng)脈綜合癥和缺血性腦血栓的預(yù)防與治療，此外還廣泛應(yīng)用于婦產(chǎn)科、 兒科、呼吸科、腫瘤和燒傷科等。
[0004] 二十世紀(jì)八十年代中期，歐洲首先開(kāi)發(fā)出低分子肝素（LMWH)，低分子肝素比普通 肝素具有更高的抗Xa因子/抗II a因子效價(jià)比，因而能大大減少抗血栓過(guò)程中造成的出血 傾向。目前，低分子肝素在臨床上得到了更廣泛的應(yīng)用，2012年全球肝素類藥物的銷售額約 為97億美元，其中75%以上是低分子肝素產(chǎn)品。低分子肝素產(chǎn)品包括鈉鹽和鈣鹽兩種形 式，不同的工藝所制備的低分子肝素，在臨床上不可互相替代。
[0005] 現(xiàn)今，國(guó)內(nèi)已上市的低分子肝素基本沒(méi)有分級(jí)，只能滿足歐洲藥典低分子肝素通 則的要求，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)如下：重均分子量< 8000,且分子量小于8000的級(jí)分 不超過(guò)總量的60%;抗Xa因子效價(jià)彡70IU/mg，抗Xa因子和抗IIa因子效價(jià)比彡1. 5,鈣鹽 中的鈣含量為9. 5-11. 5%，雜質(zhì)含量如氯離子、游離硫酸鹽、乙醇、亞硝酸鹽、硼、N-NO等， 均無(wú)明確要求。低分子肝素鈣經(jīng)過(guò)工藝改進(jìn)、并參照EP進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高后，可升級(jí)為那 屈肝素鈣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的低分子肝素鈣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，且難于獲得高純度那屈肝素鈣的 問(wèn)題，提供一種雜質(zhì)少、純度高，分子量分布范圍窄，抗Xa因子/抗II a因子效價(jià)比高的那 屈肝素鈣。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
[0008] -種高純度那屈肝素鈣，所述高純度那屈肝素鈣的重均分子量為3800~ 4800,分子量小于2000的級(jí)分占彡13%，分子量2000-4000的級(jí)分占40-55%，分子量 2000-8000的級(jí)分占80-95%，鈣含量為10. 0-11.0% ;高純度那屈肝素鈣中的雜質(zhì)，氯離 子彡0· 1%，鈉彡0· 1%，游離硫酸鹽彡0· 5%，乙醇彡0· 5%，亞硝酸鹽彡5ppm，硼彡lppm， N-NO 0. 25ppm〇
[0009] 所述高純度那屈肝素鈣由以下步驟制備：
[0010] S1、向質(zhì)量百分濃度為9-11 %的肝素鈉溶液中加入強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，調(diào)節(jié) 肝素鈉水溶液的PH至2-2. 5,然后過(guò)濾得到濾液。
[0011] 優(yōu)選的，使用800目的濾布進(jìn)行過(guò)濾。
[0012] S2、向?yàn)V液中加入質(zhì)量百分濃度為20-30%的亞硝酸鈉溶液，然后在室溫下攪拌 1- 4h，得到反應(yīng)液；亞硝酸鈉的質(zhì)量為原肝素鈉的質(zhì)量的2-3%。
[0013] 優(yōu)選的，向?yàn)V液中加入亞硝酸鈉溶液后在室溫下攪拌lh，得到反應(yīng)液。
[0014] S3、用氧化鈣中和反應(yīng)液，然后分別向反應(yīng)液中加入硼氫化鈉和氯化鈣，在室溫下 攪拌15-20h，再用鹽酸中和反應(yīng)液，得到初料液；所述硼氫化鈉的質(zhì)量為原肝素鈉的質(zhì)量 的1-2%，所述氯化鈣的質(zhì)量為原肝素鈉的質(zhì)量的2-3倍。
[0015] S4、然后用紫外光照射初料液10-60min。
[0016] 優(yōu)選的，用紫外光照射初料液60min。
[0017] S5、先用正丁醇萃取初料液，然后對(duì)初料液進(jìn)行超濾直至透過(guò)液的電導(dǎo)率 < 450 μ s/cm，得到超濾液；接著按肝素鈉的投料量計(jì)算將超濾液濃縮至4. 5-8L/Kg，得濃 縮超濾液。
[0018] 優(yōu)選的，上述步驟S5,先向初料液中加入正丁醇并攪拌lOmin，靜置后棄去上層清 液，所述正丁醇的用量按肝素鈉的投料量計(jì)算為2-3L/Kg ;接著再用等量正丁醇萃取初料 液2遍，靜置后棄去上層清液，然后再超濾初料液。
[0019] 優(yōu)選的，使用截留分子量為3KD的超濾膜對(duì)初料液進(jìn)行超濾，棄去透過(guò)液并持續(xù) 補(bǔ)加質(zhì)量百分濃度為4%的氯化鈣溶液，持續(xù)超濾3-5h，然后靜置2h，接著再持續(xù)補(bǔ)加純化 水進(jìn)行超濾直至透過(guò)液的電導(dǎo)率< 450 μ s/cm。
[0020] S6、將濃縮超濾液加入到3. 5-5倍體積的乙醇中沉淀，然后靜置使固液分層并除 去上層清液，得到料液；接著向料液中加入0. 3-1倍體積的無(wú)水乙醇并攪拌0. 5-5h，得到乙 醇料液。
[0021] S7、對(duì)乙醇料液進(jìn)行離心，使乙醇料液中的固液分離，所得固體物即為那屈肝素鈣 濕品，經(jīng)干燥后制得那屈肝素鈣成品。
[0022] 優(yōu)選的，先對(duì)乙醇料液離心使固液分離，接著用80-95%的乙醇淋洗固體物，然后 再次離心，所得固體物即為那屈肝素鈣濕品。
[0023] 干燥那屈肝素鈣濕品時(shí)，在真空度大于或等于-0. 09MPa的條件下，在常溫下干燥 2- 10h，然后再分別在 30°C、45°C、60°C、80°C 中干燥 l_15h。
[0024] 優(yōu)選的，干燥那屈肝素鈣濕品時(shí)，在常溫下干燥2-10h，然后分別在30°C、45°C、 60°C下干燥l_5h，接著再在80°C中干燥l_15h。更優(yōu)選的，在常溫下干燥2-10h，然后分別 在30°C、45°C、60°C下干燥l_3h，接著再在80°C中干燥7-10h。
[0025] 與現(xiàn)有低分子肝素鈣相比，本發(fā)明的有益效果是得到一種高純度那屈肝素鈣：本 發(fā)明通過(guò)脫鈉、裂解、還原-轉(zhuǎn)鈣、紫外光照射、萃取-超濾、醇沉-打漿、離心-干燥制備高 純度的那屈肝素鈣。向肝素鈉溶液中加入強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，一方面可使肝素鈉溶液 達(dá)到一定的pH范圍，另一方面可以通過(guò)離子交換和過(guò)濾除去肝素鈉溶液中約1/3的鈉離 子，從而降低后期轉(zhuǎn)鈣的負(fù)擔(dān)。用氧化鈣替代氫氧化鈉來(lái)中和反應(yīng)液，可減少反應(yīng)液中鈉離 子的引入量，硼氫化鈉與過(guò)量的氯化鈣同時(shí)加入反應(yīng)液中并進(jìn)行適當(dāng)時(shí)長(zhǎng)的攪拌，可獲得 更好的轉(zhuǎn)鈣效果。用紫外光照射初料液，可去除絕大部分的N-NO雜質(zhì)，使N-NO的含量達(dá)到 最嚴(yán)格的EP要求。用正丁醇萃取初料液，可除去一些大分子雜質(zhì)及一些分子量大于8000 的未降解肝素鈉，使分子量的分布范圍更窄。初料液用截留分子量為3KD的超濾膜進(jìn)行超 濾并持續(xù)補(bǔ)加氯化鈣，可使鈉鹽更徹底地轉(zhuǎn)變成鈣鹽；接著持續(xù)補(bǔ)加純化水，可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品 脫鹽，去除過(guò)量的游離鈣離子及其它無(wú)機(jī)離子，如氯離子、鈉離子、亞硝酸根離子、硫酸根離 子、偏硼酸根尚子等，并且還可除去一些分子量小于2000的小分子肝素寡糖，使分子量的 分布范圍更窄。通過(guò)控制乙醇與料液的體積比、打漿乙醇的用量、淋洗乙醇的濃度和用量、 干燥過(guò)程階段升溫等，可有效去除產(chǎn)品中殘留的乙醇溶劑，使產(chǎn)品中的乙醇含量降至0.5% 以下。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明所述的高純度那屈肝素鈣的制備流程圖；
[0027] 圖2為實(shí)施例1-3制備的高純度那屈肝素鈣的二糖結(jié)構(gòu)分析圖；
[0028] 圖3為實(shí)施例1-3制備的高純度那屈肝素鈣的四糖結(jié)構(gòu)分析圖；
[0029] 圖4為實(shí)施例1-3制備的高純度那屈肝素鈣的六糖結(jié)構(gòu)分析圖；
[0030] 圖5為實(shí)施例1制備的高純度那屈肝素鈣的核磁共振碳譜；
[0031] 圖6為EP標(biāo)準(zhǔn)品（那屈肝素鈣）的核磁共振碳譜。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作 進(jìn)一步介紹和說(shuō)明。
[0033] 本發(fā)明提供一種高純度那屈肝素鈣，所述高純度那屈肝素鈣的制備方法依次包括 脫鈉、裂解、還原-轉(zhuǎn)鈣、紫外光照射、萃取-超濾、醇沉-打漿、離心-干燥這幾個(gè)步驟，如 圖1所示。具體的制備方法如下實(shí)施例1-3所述。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 本實(shí)施例提供一種高純度那屈肝素鈣，制備所述高純度那屈肝素鈣的具體步驟如 下：
[0036] (1)脫