10. 5mg/L絲氨酸、100U/mL青霉素和100 y g/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液（Gibco, USA) 中，放入37°C孵箱中培養(yǎng)，2-3天形成克隆，10-14天可形成單層活性的晶體干細胞細胞。
[0044] 1. 2鑒定：對分離培養(yǎng)得到的細胞進行鑒定：包括形態(tài)學（光學顯微鏡下）觀察和 免疫熒光觀察：
[0045](1)形態(tài)學觀察
[0046] 在倒置相差顯微鏡（OLYMPUS1X81)下觀察細胞的形態(tài)結(jié)構。
[0047] (2)免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡觀察
[0048]細胞制備細胞爬片，長至70%~80%匯合時取出，用4%多聚甲醛固定20分鐘，然 后用含0. 3%TritonX-100的PBS透化10分鐘，并用含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液中 止反應，然后在4°C下過夜孵育初級抗體，在PBS中洗滌3次后，細胞與二次抗體在室溫下孵 育1小時。細胞核經(jīng)DAPI染色。
[0049] 實驗中使用的抗體如下：山羊抗S0X2多克隆抗體（Santa Cruz公司），兔抗PAX6 多克隆抗體（PRB-278P，Covance公司），二次抗體為Alexa Fluor488或568標記的抗小鼠 或兔免疫球蛋白（IgG) (Invitrogen公司），使用的稀釋度為1:500。用奧林巴斯FV1000共 聚焦顯微鏡觀察、拍照。
[0050] 2?實驗結(jié)果
[0051] (1)細胞形態(tài)：
[0052] 如圖1所示，倒置相差顯微鏡下，貼壁細胞呈鵝卵石狀，即典型的上皮細胞形態(tài)。
[0053] (2)免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡觀察
[0054] 如圖2所示，本發(fā)明分離得到的細胞表達上皮干細胞的標志物Pax6和Sox2。
[0055] 實驗結(jié)果說明，本發(fā)明方法可以分離培養(yǎng)得到的晶狀體上皮干細胞。
[0056] 實施例2兔眼晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定
[0057] 1.細胞分離培養(yǎng)
[0058] 所有的動物研究完全按照眼科和視覺研究用動物ARV0聲明及相關批準執(zhí)行。從 新西蘭白兔取出眼球，含有抗生素的PBS沖洗3次。角膜和虹膜被移除后，在晶狀體囊后 切一個小切口，取下晶狀體前囊膜及附著的上皮并切成IX 1_2,碎片放于離心管中先放 有5ml 0. 2%的膠原酶IV獲得細胞團。再將離心管放入37°C培養(yǎng)箱中，輕輕搖動2小時 進行消化。2小時后，離心細胞，在lOOOrpm離心5分鐘，在室溫下真空抽吸的膠原酶。添 加0.25 %胰蛋白酶-EDTA 5毫升，并通過100um的細胞過濾網(wǎng)。濾過細胞培養(yǎng)在補充有 20%胎牛血清，100 ii g/L FGF、5-10mg/L胰島素、5-10mg/L氫化可的松、5-10mg/L霍亂弧菌 毒素、0? 01-0. 05mg/L3, 3'，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸、l-5mg/L腺噪呤、7. 5mg/L甘氨酸、 8. 9mg/L丙氨酸、13. 2mg/L天冬酰胺、13. 3mg/L天冬氨酸、14. 7mg/L谷氨酸、11. 5mg/L脯氨 酸、10. 5mg/L絲氨酸和50 y g/L慶大霉素的最低必需培養(yǎng)基（最低必需培養(yǎng)基即MEM培養(yǎng) 液）中培養(yǎng)，并在2% Matrigel鋪板后的六孔板中培養(yǎng)，放入37°C孵箱中培養(yǎng)，2-3天形成 克隆，10-14天可形成單層活性的晶體干細胞細胞。
[0059] 2、檢測
[0060] 2. 1免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡
[0061] 用4%多聚甲醛固定細胞20分鐘，然后用含0.3% Triton X-100的PBS透化10分 鐘，并用含5%牛血清白蛋白的PBS溶液中止反應，然后在4°C下過夜溫育初級抗體，在PBS 中洗滌3次后，細胞與二次抗體在室溫下孵育1小時。細胞核都經(jīng)DAPI染色。
[0062] 實驗中使用的抗體如下：山羊抗Sox2多克隆抗體（Santa Cruz公司），兔抗Pax6 多克隆抗體（PRB-278P，Covance公司），鼠抗Ki67單克隆抗體（550609, BD公司），二次抗 體為Alexa Fluor 488或568標記的抗小鼠或兔免疫球蛋白（IgG) (Invitrogen公司），使 用的稀釋度為1:500。用奧林巴斯FV1000共聚焦顯微鏡觀察紀錄。
[0063] 2. 2與成熟的晶體纖維細胞的比較（實時熒光定量PCR)
[0064] 為了進一步證實培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞的干細胞狀態(tài)，對本發(fā)明分離培養(yǎng)的細胞 與成年兔晶狀體纖維細胞（無囊膜）之間基因的表達水平進行了檢測。
[0065] 使用RNeasy試劑盒（Qiagen公司）提取RNA,并進行上柱，DNA酶消化。按照制造 商的說明書（Invitrogen公司）使用Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，合成cDNA。定量 PCR使用7500實時定量PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，Inc.)。基因特異性引物（見表1) 和SYBR Green PCR擴增試劑預混，40次循環(huán)擴增。每個測試重復3次，并用內(nèi)源性GAPDH 水平歸一化數(shù)據(jù)。使用A ACT法（CT值〈30)計算相對表達倍數(shù)變化。
[0066] 表1實時定量PCR引物
【主權項】
1. 一種晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于：它包括以下步驟： (1) 取晶狀體前囊膜及附著的上皮，剪成碎片，消化，將獲得的細胞鋪于包被有基質(zhì)的 培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中； (2) 加入添加有 15 ~25%FBS、50 ~150iig/LFGF、5-10mg/L胰島素、5-10mg/L氫化 可的松、5-10mg/L霍亂弧菌毒素、0? 01-0. 05mg/L3, 3'，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸、l-5mg/ L腺噪呤、5~10mg/L甘氨酸、6~12mg/L丙氨酸、10~16mg/L天冬酰胺、10~16mg/L天 冬氨酸、12~18mg/L谷氨酸、8~15mg/L脯氨酸、7~14mg/L絲氨酸的MEM培養(yǎng)液，放入 37°C孵箱中培養(yǎng)，得有活性的細胞，即得晶狀體上皮干細胞。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述消化的方法是：將碎片加0. 2 %的膠 原酶IV溶液中，消化2h，去除膠原酶，加入0. 25%胰蛋白酶-EDTA溶液，混勻，過濾，即得細 胞。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所述基質(zhì)為基質(zhì)膠、明膠、膠 原、多聚賴氨酸和/或?qū)诱尺B蛋白中的一種或兩種以上的組合。
4. 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿包被基質(zhì)膠的方 法為：加入含1%~3%基質(zhì)膠的DMEM/F12培養(yǎng)液或無菌PBS溶液，完全覆蓋底部即可，在 37°C孵箱中孵育0. 5~2小時，孵育完后吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS清洗3~5次。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：所述基質(zhì)膠的濃度為2% ;孵育的時間為 1小時。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，F(xiàn)BS濃度為20%，F(xiàn)GF濃度 為IOOiig/L,胰島素濃度為10mg/L,氫化可的松濃度為10mg/L,霍亂弧菌毒素濃度為IOmg/ L，3, 3'，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸濃度為0. 01mg/L，腺嘌呤濃度為5mg/L，甘氨酸濃度為 7. 5mg/L、丙氨酸濃度為8. 9mg/L、天冬酰胺濃度為13. 2mg/L、天冬氨酸濃度為13. 3mg/L、谷 氨酸濃度為14. 7mg/L、脯氨酸濃度為11. 5mg/L、絲氨酸濃度為10. 5mg/L。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，培養(yǎng)液中還含有抗生素；所 述的抗生素為50~lOOU/mL的青霉素和50~100iig/mL的鏈霉素。
8. -種晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)液，其特征在于：它是添加有15~25%FBS、 50~150yg/LFGF、5_10mg/L胰島素、5-10mg/L氫化可的松、5-10mg/L霍亂弧菌毒素、 0? 01-0. 05mg/L3, 3'，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸、l_5mg/L腺噪呤、5~10mg/L甘氨酸、6~ 12mg/L丙氨酸、10~16mg/L天冬酰胺、10~16mg/L天冬氨酸、12~18mg/L谷氨酸、8~ 15mg/L脯氨酸、7~14mg/L絲氨酸的MEM培養(yǎng)液。
9. 根據(jù)權利要求8所述的培養(yǎng)液，其特征在于：FBS濃度為20 %，F(xiàn)GF濃度為100iig/ L,胰島素濃度為10mg/L,氫化可的松濃度為10mg/L,霍亂弧菌毒素濃度為10mg/L, 3, 3 '，5-碘-L-對羥基苯丙氨酸濃度為0. 01mg/L，腺嘌呤濃度為5mg/L，甘氨酸濃度為 7. 5mg/L、丙氨酸濃度為8. 9mg/L、天冬酰胺濃度為13. 2mg/L、天冬氨酸濃度為13. 3mg/L、谷 氨酸濃度為14. 7mg/L、脯氨酸濃度為11. 5mg/L、絲氨酸濃度為10. 5mg/L。
10. 根據(jù)權利要求8所述的培養(yǎng)液，其特征在于：所述培養(yǎng)液中還含有抗生素；所述的 抗生素為50~lOOU/mL的青霉素和50~100iig/mL的鏈霉素。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)方法，它包括以下步驟：(1)取晶狀體前囊膜，剪成碎片，消化，將獲得的細胞鋪于包被有基質(zhì)的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中；(2)加入添加有含有15～25％FBS、50～150μg/L人表皮生長因子(FGF)、5-10mg/L胰島素、5-10mg/L氫化可的松、5-10mg/L霍亂弧菌毒素、0.01-0.05mg/L3,3′,5-碘-L-對羥基苯丙氨酸、1-5mg/L腺嘌呤、5～10mg/L甘氨酸、6～12mg/L丙氨酸、10～16mg/L天冬酰胺、10～16mg/L天冬氨酸、12～18mg/L谷氨酸、8～15mg/L脯氨酸、7～14mg/L絲氨酸的MEM培養(yǎng)液，放入37℃孵箱中培養(yǎng)，2-3天形成克隆，10-14天可形成單層活性的晶體干細胞細胞。本發(fā)明還公開了一種晶狀體上皮干細胞的分離培養(yǎng)液。本發(fā)明方法可以分離得到原代晶狀體上皮干細胞，干細胞的活性高，本發(fā)明方法簡便、易操作，應用前景良好。
【IPC分類】C12N5-074
【公開號】CN104789521
【申請?zhí)枴緾N201510032551
【發(fā)明人】侯睿, 蔡惠民
【申請人】廣州康睿生物醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年1月22日