一種鹿茸生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鹿茸生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，由于分子生物學(xué)研宄領(lǐng)域的成就促進了轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的蓬勃發(fā)展。目前研宄成功并能夠產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的生物反應(yīng)器主要有細菌反應(yīng)器、昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)、真菌系統(tǒng)、哺乳動物細胞和活體生物反應(yīng)器等。已有的生物反應(yīng)器各有各的特點，如細菌反應(yīng)器表達量大，成本低廉，但所表達的許多哺乳動物的基因產(chǎn)物都不具生物活性；哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)成本極高，表達量很低，但能表達那些低等表達系統(tǒng)不能表達的哺乳動物的活性因子。以動物乳腺反應(yīng)器為代表的活體表達系統(tǒng)，一經(jīng)建立，不但表達量大、成本低、表達的時間長。然而乳腺反應(yīng)器也并非十全十美，如乳腺反應(yīng)器研制周期受到動物生長繁殖周期的限制。另外，也不是所有的生物活性因子都適合用乳腺反應(yīng)器來表達。
[0003]鹿茸是鹿頭部的衍生物，生長速度極快(可達2cm/d)，在60天的生長期中可生產(chǎn)20-30kg重的茸組織。研宄表明，鹿一生中所生長的約130kg鹿茸組織全部來源于頭部生茸區(qū)骨膜。該骨膜含有大約5百萬個細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種鹿茸生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，采用的技術(shù)方案如下:
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鹿茸生物反應(yīng)器的構(gòu)建方法，該方法是制備含有外源基因的慢病毒顆粒，將慢病毒顆粒結(jié)合磁性載體后感染生茸區(qū)骨膜，檢測標記基因或外源基因的表達情況，獲得鹿茸生物反應(yīng)器。
[0006]所述方法，步驟如下:
[0007]I)構(gòu)建含有外源基因的質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA，將DNA與轉(zhuǎn)染試劑混合共轉(zhuǎn)染包裝細胞制備慢病毒顆粒，測定慢病毒顆粒的滴度；
[0008]2)將含有磁性載體的PBS溶液與步驟I)獲得的慢病毒顆?；旌希苽浯判暂d體偶聯(lián)的慢病毒載體，作為病毒液；
[0009]3)將步驟2)所得病毒液注射到生茸區(qū)骨膜與骨質(zhì)之間，磁板覆蓋在注射位置，靜置30min，將目標基因?qū)牍悄じ杉毎?，一周后重?fù)操作，重復(fù)操作3次；
[0010]4)當生茸區(qū)發(fā)育到5?8cm高時，麻醉鹿后取下兩側(cè)茸尖，檢測標記基因或外源基因的表達情況，獲得鹿茸生物反應(yīng)器。
[0011]步驟I)所述包裝細胞，為293t細胞。
[0012]步驟I)所述質(zhì)粒，為質(zhì)粒pLVTHM、質(zhì)粒pCMV_dr8.91和質(zhì)粒pMD2.G，質(zhì)粒質(zhì)量之比為 pLVTHM:pCMV-dr8.91:pMD2.G = 2:1.5:0.75。
[0013]步驟I)所述轉(zhuǎn)染試劑，為Lipofectamine 2000 ;所述DNA和轉(zhuǎn)染試劑，用無血清Opt1-MEM進行稀釋；所述轉(zhuǎn)染，是在37°C，5% CO2孵箱中進行。
[0014]步驟I)所述測定慢病毒顆粒的滴度，是利用梯度稀釋法進行測定。
[0015]步驟2)所述慢病毒顆粒，滴度為I X 108TU/mL。
[0016]步驟2)所述磁性載體，為ViroMag R\L。
[0017]步驟4)所述標記基因，是位于質(zhì)粒pLVTHM上的GFP基因。
[0018]所述方法具體步驟為:
[0019]I)構(gòu)建含有外源基因的質(zhì)粒，提取質(zhì)粒pLVTHM、質(zhì)粒pCMV_dr8.91和質(zhì)粒pMD2.G的DNA，將經(jīng)過無血清Opt1-MEM稀釋的DNA和Lipofectamine 2000室溫孵育5min后混合，混合液在室溫孵育30min ;所述質(zhì)粒質(zhì)量比為pLVTHM:pCMV-dr8.91:pMD2.G = 2:1.5:
0.75 ；
[0020]2)將步驟I)所得混合液與293t細胞置于已用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，在37°C,5% CO2的孵箱中進行共轉(zhuǎn)染，獲得濃縮病毒液，_80°C或液氮保存；
[0021]3)將293t細胞消化并計數(shù)后稀釋，加入96孔板中孵箱培養(yǎng)，12h后利用梯度稀釋法進行測定滴度；
[0022]4)將PBS和磁性載體ViroMagR\L混合后冰上孵育，加入滴度為I X 108TU/mL的慢病毒顆粒，冰上孵育制備磁性載體偶聯(lián)的慢病毒載體，作為病毒液；
[0023]5)將步驟4)所得病毒液注射到生茸區(qū)骨膜與骨質(zhì)之間，磁板覆蓋在注射位置，靜置30min，縫合傷口后解除麻醉；一周后重復(fù)操作，共重復(fù)3次；
[0024]6)每隔兩周進行觀測，生茸區(qū)發(fā)育到5?8cm高時，麻醉實驗鹿取下兩側(cè)茸尖，制備組織切片，檢測外源基因的表達情況，獲得鹿茸生物反應(yīng)器。
[0025]所述的方法適用于構(gòu)建鹿茸生物反應(yīng)器。
[0026]所述GFP基因不僅可以作為一種外源基因，同時它也是指示病毒導(dǎo)入成功的標
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[0027]本發(fā)明通過構(gòu)建合適的含有外源基因的病毒載體，利用顯微注射的方式將磁性載體偶聯(lián)的慢病毒載體，使慢病毒在生茸區(qū)骨膜組織處停留并最大限度地將目標基因?qū)牍悄じ杉毎?，從而實現(xiàn)外源標記基因在后生鹿茸中表達，從而構(gòu)建鹿茸生物反應(yīng)器。本發(fā)明所述方法適用于導(dǎo)入所有外源基因。
[0028]本發(fā)明有益效果:
[0029]1.可以人為改造鹿茸中有益成分，如導(dǎo)入合適的干擾片段抑制骨化調(diào)節(jié)基因CBFAl的表達，從而提高鹿茸中軟骨成分的含量，提高鹿茸蠟片產(chǎn)量，提高鹿茸的附加值促進農(nóng)戶增收。
[0030]2.本發(fā)明還可以提高鹿茸中某種有益成分的含量，如導(dǎo)入鹿茸中特有的刺激血管生成的多肽A44的編碼核酸序列，可以提高改造鹿茸中改蛋白的含量，提取后可以應(yīng)用于藥物研發(fā)。
[0031]3.本發(fā)明生成的鹿茸生物反應(yīng)器，可以隨著鹿茸每年周期性再生，重復(fù)獲取，即一次改造終身有效。
[0032]4本發(fā)明對鹿個體改造僅局限于決定鹿茸生成的骨膜組織，外源基因僅表達與后生的鹿茸組織中，更符合動物倫理要求。
【附圖說明】
[0033]圖1三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24h后293t細胞生長(左)及GFP表達情況(右)。
[0034]圖2慢病毒顆粒結(jié)合磁性載體感染生茸干細胞；
[0035](A，備皮后雙側(cè)生茸區(qū)；B，單側(cè)生茸區(qū)發(fā)育高度(約1.5cm) ;C，去除皮下結(jié)締組織后生茸區(qū)骨膜；D，含磁性載體ViroMag R/L的病毒液；E，病毒液注射到生茸區(qū)骨膜中；F，通過磁板將磁性載體綁定的病毒顆粒鎖定在注射部位；G，采集前實驗茸生長情況，雙側(cè)茸發(fā)育高度(約6cm))。
[0036]圖3鹿茸冰凍切片熒光觀測；
[0037](A，實驗組熒光觀測；B，實驗組可見光觀測；C，對照組熒光觀測；D，對照組可見光觀測)
[0038]圖4鹿茸冰凍切片熒光觀測；
[0039](A，實驗組熒光觀測；B，實驗組可見過觀測；C，對照組熒光觀測；D，對照組可見光觀測)。
[0040]圖5LacZ在鹿茸中的表達；
[0041](A，鹿茸縱向切片觀察LacZ表達；B，LacZ在鹿茸間充質(zhì)組織中表達；C，LacZ在鹿茸前軟骨組織中表達；D，LacZ在鹿茸軟骨組織中表達；E，LacZ在鹿茸骨組織中表達)。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0043]實施例1
[0044]1.慢病毒顆粒的制備及純化
[0045]取出一定數(shù)目的1cm細胞培養(yǎng)皿，每板中加入4mL 0.01 %的多聚賴氨酸，左右顛倒，使液體平鋪于板底，室溫下孵育1min后去除多聚賴氨酸，每皿加入13mLDMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)及一定數(shù)量293t細胞，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37°C，5% CO2)。對于每板細胞，使用 1.5mL無血清 Opt1-MEM稀釋 24 μ g DNA(pLVTHM:pCMV-dr8.91:pMD2.G質(zhì)粒質(zhì)量之比為 2:1.5:0.75)，使用 1.5mL 無血清 Opt1-MEM 稀釋 51 4 14專染試劑1^口(^6(^3111丨1^2000，室溫下孵育5min。將稀釋的DNA和稀釋的LIPOFECTAMINE 2000混合于一體，混合液在室溫孵育30min。吸去1cm細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液將復(fù)合物加入到細胞培養(yǎng)皿中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。將細胞培養(yǎng)皿在37°C，5% CO2，孵箱孵育5h，5h后更換DMEM完全培養(yǎng)基(10%FBS、1%谷氨酰胺、雙抗100U/mL)。轉(zhuǎn)染后24h時，觀測轉(zhuǎn)染情況(圖1)，小心吸取1cm細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液于一干凈無菌的50mL離心管中，1000rpm/min離心5min棄去細胞碎片沉淀。使用0.45 μ m濾膜過濾上清液，將