漠化錠（CTAB)，2% (W/V)聚己締化咯燒酬（PVP)， 100毫摩/升S哲甲基氨基甲燒-鹽酸緩沖液（Tris-HCl，pH8.0)，0. 5克/升亞精胺 (Spermidine),2.0摩/升的氯化鋼（化Cl)，2%琉基己醇（V/V，使用前加入)，上述濃度均為 所述物質(zhì)在RNA提取液中的終濃度)，顛倒混勻；于65°C水浴3分鐘，期間混勻2~3次；隨后 用等體積氯仿：異戊醇(體積比24:1)抽提2次(在室溫下，于10,000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、5分 鐘);取上清，加入上清液1/4體積的10摩/升的氯化裡（LiCl)溶液，于4°C放置6小時，W 等體積酪（pH4. 5):氯仿：異戊醇(體積比25:24:1)和等體積氯仿：異戊醇(體積比24:1) 各抽提1次(在室溫下，于10, 000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、5分鐘）；繼而加入上清液2倍體積的無水 己醇，在-70°C沉淀30分鐘W上后，于4°C，W12, 000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離屯、20分鐘，棄上 清；取沉淀用500微升經(jīng)焦碳酸二己醋（DEPC)處理的水溶解；并W等體積酪（PH4. 5):氯 仿：異戊醇(體積比25:24:1)和等體積氯仿：異戊醇(體積比24:1)各抽提1次(在室溫下， 于10, 000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、5分鐘）；加上清液2. 5倍體積的無水己醇，在-70°C沉淀30分鐘 W上；于4°C，W12, 000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離屯、20分鐘，棄上清；沉淀用70% (體積濃度）的 酒精漂洗一次，風(fēng)干；再加200微升的經(jīng)焦碳酸二己醋（DEPC)處理的水溶解后；用非變性瓊 脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量。
[0024]實(shí)施例2;cDNA第一鏈的合成； 取約10微克總RNA加入到焦碳酸二己醋處理的擴(kuò)增管中，65°C水浴10分鐘使RNA變 性后，立即冰浴3分鐘；然后向擴(kuò)增管中依次加入2微升lO'RNA反應(yīng)緩沖液(寶生物工程 有限公司，中國大連)，4微升25毫摩/升的氯化儀(MgC12)，2微升10毫摩/升脫氧核糖 核巧=磯酸（dNTPs)，5單位逆轉(zhuǎn)錄酶，0. 5微升RNA酶抑制劑（20單位）和1微升2. 5微 摩/升T重復(fù)寡核巧酸（Oligo-dT) 3'接頭，加入經(jīng)焦碳酸二己醋處理的水至終體積20微 升。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)椋?0°C，10分鐘；50°C，45分鐘；95°C，5分鐘；5°C，5分鐘。程序結(jié)束 后，于-20°C凍存產(chǎn)物。
[00巧]實(shí)施例3;化SF化-1基因在棉花不同組織器官和纖維胚珠不同發(fā)育時期中的表 達(dá)特性； 由于棉花纖維是胚珠外珠被表皮細(xì)胞經(jīng)極性伸長而成，因此纖維細(xì)胞是胚珠表皮細(xì)胞 的一部分。為了篩選棉花纖維特異或優(yōu)勢表達(dá)的啟動子，發(fā)明人通過篩選纖維細(xì)胞伸長期 cDNA文庫，獲得一個在纖維細(xì)胞伸長期優(yōu)勢表達(dá)的基因，該基因與其它物種的花粉特異性 蛋白基因SF3同源，命名為化SF化-1 (SF3L化e-1)基因，cDNA序列為SEQIDNO. 2; 運(yùn)用實(shí)時定量PCR擴(kuò)增分析化SF化-1的表達(dá)水平，用cDNA第一鏈合成試劑盒（MBI) 合成棉花不同器官和組織總RNA的第一鏈cDNA，操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。采用實(shí)時 定量PCR試劑盒（Bio-Rad)進(jìn)行擴(kuò)增，在20微升的反應(yīng)體系中包括10微升的混合緩沖液 (Bio-Rad), 5'-端和3'-端引物各1微升（5微摩/升)。循環(huán)參數(shù)為94°C預(yù)變性3分鐘； 94°C，30秒，55°C，30秒，72°C，30秒，預(yù)設(shè)循環(huán)數(shù)為40。用棉花化stone3基因作內(nèi)標(biāo)， Histone3 的 5' -引物是化HIS1 (5' -GAAGCCTCATCGATACCGTC-3'）（SEQIDNO. 3)，3' -引物 為化HIS2 (5' ' -CTACCACTACCATCATGGC-3'）（SEQIDNO. 4);擴(kuò)增化SF化-1 基因的 5' -引 物序列為化SF化-1-1 (5' -GCATCATCTTCCGATTCGACT-3'）（SEQIDNO. 5)，3' -引物序列為 化SF：3L-l-2 (5'-GACTTGCAGCCTTCTTCTCAG-3')(SEQIDNO.6)。
[0026]按上述實(shí)施例1和2的方法獲得棉花不同組織器官和纖維胚珠不同發(fā)育時期的總RNA進(jìn)行實(shí)時定量RT-PCR分析；在運(yùn)行實(shí)時定量PCR前，用相同引物和模板在相同的溫度 調(diào)控程序中擴(kuò)增一次，通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳，確保擴(kuò)增產(chǎn)物是單帶，每個樣品重復(fù)3次。
[0027] 圖1顯示姑基因在棉花不同器官和組織中W及纖維和胚珠不同發(fā)育時期 的表達(dá)； 0F-0DPA~0F-4DPA:開花當(dāng)天的棉花胚珠(含纖維細(xì)胞）至開花后4天的棉花胚珠 (含纖維細(xì)胞）；F-抓PA~F-18DPA:開花后6天的纖維細(xì)胞至開花后18天的纖維細(xì)胞； 0-抓PA~0-18DPA:開花后6天的棉花胚珠至開花后18天的棉花胚珠。其中，誤差椿表示3 次生物學(xué)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。
[002引此圖說明化SF化-1基因在棉花花藥和纖維細(xì)胞的發(fā)育早期表達(dá)；在纖維中的表 達(dá)高峰出現(xiàn)在纖維細(xì)胞快速伸長期（F-10DPA左右)。
[0029] 結(jié)果如圖1所示，化SF化-1基因在棉花根、下胚軸、葉和莖中無表達(dá)、在花藥中表 達(dá)量最高，在開花當(dāng)天的胚珠(含纖維）中無表達(dá)，在開花后4天的胚珠(含纖維）中有少量 表達(dá)，在開花后6天的纖維中表達(dá)量較高，表達(dá)峰值出現(xiàn)在開花后10天的纖維細(xì)胞中，在開 花后14天的纖維中表達(dá)水平迅速下降（圖1 )，在胚珠中幾乎無表達(dá)。說明化SF化-1基因具 有明顯的花粉和纖維細(xì)胞表達(dá)優(yōu)勢。而且在纖維發(fā)育過程中，隨著纖維的伸長生長，該基因 的表達(dá)水平快速增加，在開花后6天和12天的纖維細(xì)胞中的表達(dá)量較高；隨后逐漸降低，在 開花18天后的纖維細(xì)胞中幾乎檢測不到該基因的表達(dá)（圖2)。在整個胚珠發(fā)育過程中，該 基因的表達(dá)水平極低。由此說明化SF化-1基因在花粉和纖維中特異表達(dá)，而且在纖維細(xì)胞 快速伸長期表達(dá)水平較高，在胚珠中基本不表達(dá)。
[0030] 實(shí)施例4;棉花基因組DNA的提??； 采用改良的十六烷基S甲基漠化錠（CTAB)法提取棉花基因組DNA。取0.5克棉花幼 葉，在液氮中迅速研磨成粉，加入3毫升65°C預(yù)熱的十六烷基=甲基漠化錠（CTAB)提取液， 快速振蕩混勻。65°C水浴30分鐘，然后加入1毫升5摩/升醋酸鐘（KAc)，冰浴20分鐘后， 用等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提1次（12, 000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離屯、5分鐘)，取上清， 加入上清液2/3倍體積的-20°C預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置約30分鐘，挑出絮狀沉淀，用75% (體積濃度）的己醇反復(fù)漂洗3次，再用無水己醇漂洗1次，吹干，重溶于500微升TE緩沖 液（10毫摩的Tris-cl(PH值8.0)和1毫摩的邸TA(PH值8.0)(邸TA;S哲甲基氨基甲 燒-己二胺四己酸二鋼)中；再加入1微升RNA酶A(10毫克/毫升)，37°C處理1小時；再 用等體積酪：氯仿：異戊醇（25:24:1)和等體積氯仿：異戊醇（24:1)各抽提1次（12, 000 轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離屯、5分鐘)，取上清，加入上清液2倍體積的無水己醇沉淀DNA;于-20°C 放置約30分鐘，離屯、（12, 000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離屯、5分鐘)，棄上清，沉淀用75%的己醇(體 積濃度）漂洗，風(fēng)干，溶于200微升TE緩沖液（同前）中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 實(shí)施例5;化SF化-1基因5'-上游調(diào)控序列的獲得； 采用YADE(Y-shapedAdaptorDependantExtensionK肖月華，羅明，方衛(wèi)國，羅 克明，侯磊，羅小英，裴炎。利用YADE法進(jìn)行棉花基因組PCR步行.遺傳學(xué)報(bào)，2002,29 (1)，62-66)法進(jìn)行化SF化-1基因的步行。
[003引酶切目標(biāo)基因組DNA;將2微克基因組DNA用10U的內(nèi)切酶按說明書的條件在20 微升體系中酶切過夜，70°C滅活10分鐘。
[0033] 準(zhǔn)備接頭：向擴(kuò)增管中加入2微升接頭短鏈（100微摩/升）（接頭序列與使用的 內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)相匹配)，抓T4多聚核巧酸激酶，1微升10毫摩/升腺巧=磯酸（ATP)，10 微升體系，37°C保溫30分鐘，70°C滅活10分鐘；加入2微升10X退火緩沖液，2微升接頭 長鏈（100 微摩 / 升）（5' -CGGTAGGATCCCGCAGAACGACGGCCAG-3'）和6微升水，65°C保溫 10 分鐘，緩慢冷卻到室溫，使長短鏈退火形成接頭。
[0034] 連接接頭：取2微升W上方法準(zhǔn)備好的接頭（10微摩/升）和5納克酶切產(chǎn)物，加 5UT4連接酶，16°C連接16小時。
[00巧]線性擴(kuò)增；第一步為線性擴(kuò)增，25微升體系中含1微升連接產(chǎn)物，IXExTaq Buffer(無Mg")，200微摩/升脫氧核糖核巧...