1,5-戊二胺的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及1，5-戊二胺的制備方法，具體地講，涉及用賴氨酸脫羧酶進(jìn)行催化合 成1，5-戊二胺的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】 1，5-二氨基戊烷（也稱為1，5-戊二胺，簡稱戊二胺）是化學(xué)工業(yè)中重要的5碳化合 物，主要用途是制造聚酰胺、聚氨酯等，另外還可以用來制造異氰酸酯、吡啶、哌啶等重要化 工原料。
[0003] 迄今為止，二胺類物質(zhì)由石油基原材料經(jīng)二羧酸中間體或者通過氨基酸的化學(xué)脫 羧作用進(jìn)行化學(xué)生產(chǎn)（Albrecht，Klaus 等人；Plastics ;Winnacker_Kuechler (第 5 版） (2005))。油價的升高使利用可再生原材料通過生物工程學(xué)的方法合成二胺類物質(zhì)成為理 想途徑。
[0004] 利用生物法合成戊二胺的方法主要有兩種。一種是使用微生物利用葡萄糖通過復(fù) 雜的代謝調(diào)控，轉(zhuǎn)化得到戊二胺，即從生產(chǎn)賴氨酸的微生物開始，通過引入編碼賴氨酸脫羧 酶的任選基因可以產(chǎn)生戊二胺，以下文獻(xiàn)中得到描述（Tabor, Herbert, etal; Journal of bacteriology (1980)，144(3)，952-956)。2007 年 Takashi 等報道了通過對具有較高賴氨 酸合成能力的谷氨酸棒桿菌進(jìn)行賴氨酸脫羧酶過量表達(dá)，使菌體直接在發(fā)酵過程中生產(chǎn)戊 二胺，產(chǎn)量為2. 9g/l。在提高戊二胺產(chǎn)量研究中，研究人員嘗試使用了具有過量表達(dá)宿主 同源的賴氨酸脫羧酶（cadA)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株(見專利JP2002-223770, JP2008104453A 等)。贏創(chuàng)德固賽在申請?zhí)枮镃N200810005332的專利中采用過量表達(dá)賴氨酸脫羧酶的產(chǎn)賴 氨酸谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)戊二胺，戊二胺在培養(yǎng)液中含量約為3. 4g/L。綜上所述，微生物 經(jīng)過葡萄糖直接發(fā)酵生產(chǎn)戊二胺，工藝簡單，但發(fā)酵周期長，且菌體對胞內(nèi)戊二胺的耐受程 度有限，導(dǎo)致戊二胺的產(chǎn)率較低，不利于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 在更進(jìn)一步的研究中，研究人員研究了生物催化方法生產(chǎn)戊二胺，即培養(yǎng)表達(dá)了 賴氨酸脫羧酶之后的大腸桿菌，將不同形式生物來源賴氨酸脫羧酶作為催化劑來催化外部 進(jìn)料的賴氨酸（見 JP2002-223771、JP2004-000114、EP1482055、JP2005-060447 等）。例如， 三菱化學(xué)株式會社在申請?zhí)枮?00880001874的專利中采用過量表達(dá)了 cadA的大腸桿菌 催化賴氨酸己二酸鹽，在反應(yīng)過程中控制反應(yīng)pH值來提高酶的穩(wěn)定性。之后三菱化學(xué)株 式會社在申請?zhí)枮镃N200980121108的專利中采用賴氨酸碳酸鹽為底物進(jìn)行催化生產(chǎn)戊二 胺，將反應(yīng)過程中釋放的二氧化碳回收利用控制反應(yīng)pH值。三井化學(xué)株式會社在申請?zhí)枮?CN201180010677的專利中將表達(dá)cadA的菌株進(jìn)行處理后催化外源賴氨酸生產(chǎn)戊二胺，用 于提商戊-胺的廣率。
[0006] 綜上所述，利用微生物生產(chǎn)的賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸生成戊二胺的研究較多， 其特點為多采用純化的賴氨酸或賴氨酸鹽，需要對賴氨酸進(jìn)行純化，工藝復(fù)雜，環(huán)境污染 大，戊二胺生產(chǎn)成本高，限制了戊二胺的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 因此需要一種工藝更簡單、經(jīng)濟(jì)，環(huán)境污染小，可實現(xiàn)戊二胺的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的合成 方法。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)成本低、工藝簡單的戊二胺合成方法。
[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題可以通過以下實施方案得以解決： 一種1，5-戊二胺的制備方法，包括將賴氨酸脫羧酶加入賴氨酸發(fā)酵液。
[0010] 該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中使用賴氨酸純品、賴氨酸鹽酸鹽、賴氨酸硫酸鹽、賴氨酸 碳酸鹽和賴氨酸二羧酸鹽等作為底物導(dǎo)致的成本高、工藝復(fù)雜等缺點。此外，反應(yīng)pH值允 許范圍較寬，可以少加甚至不加酸堿調(diào)控。因此，本發(fā)明減少了賴氨酸發(fā)酵液的純化步驟， 工藝更簡單，節(jié)約了成本。
[0011] 具體實施方案 本發(fā)明基于發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)：將賴氨酸脫羧酶加入賴氨酸發(fā)酵液中，得到了含有戊 二胺的混合液。
[0012] 本發(fā)明中所述的賴氨酸發(fā)酵液為賴氨酸發(fā)酵原液，上述賴氨酸發(fā)酵原液的濃縮液 或稀釋液，上述賴氨酸發(fā)酵原液去除菌體后的除菌賴氨酸發(fā)酵液和上述除菌賴氨酸發(fā)酵液 的濃縮液或稀釋液。
[0013]本申請中所述的賴氨酸發(fā)酵原液可以通過現(xiàn)有技術(shù)制備，例如可以參考以下文 獻(xiàn)："基于穩(wěn)健性設(shè)計優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵過程"，孫玉華等，生物技術(shù)通訊，2007,18卷1期； "賴氨酸發(fā)酵工業(yè)化研究--賴氨酸流加發(fā)酵中氮源濃度的選擇及控制模式"，尹洪波等， 食品與發(fā)酵工業(yè)，1999年12月；"梯度溫度法提高L-賴氨酸發(fā)酵水平的研究"，廉少杰等， 食品工業(yè)科技，2012年第8期；以及"賴氨酸搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化"，尹洪波等，無錫輕工大 學(xué)學(xué)報，1999年6月。另外還可以參考專利文件CN201210009446. 1，CN201210009450. 8， CN201210009366. 6, CN 201210132764. 7記載的賴氨酸發(fā)酵原液制備方法。
[0014]本發(fā)明對賴氨酸發(fā)酵所使用的微生物沒有任何特別的限制。菌株可以是本領(lǐng)域 中已知可用于賴氨酸發(fā)酵的微生物，例如棒狀桿菌屬（CbiTfldacteriwfl?)菌株，尤其是谷 氨酸棒桿菌(C 北京棒桿菌(C ("發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸的研 究--AS1. 563菌中間試驗報告"，常州味精廠，江蘇發(fā)酵，1978年12月；"北京棒狀桿菌 AS 1. 563發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸研究的擴(kuò)大試驗"，常州味精廠，微生物學(xué)通報，1980年3月）， 鈍齒棒桿菌（C 可以是短桿菌屬菌株，尤其是乳糖發(fā)酵短 桿菌(漢黃色短桿菌（5. ("L-賴氨酸產(chǎn)生菌選育及其發(fā)酵條 件的調(diào)控"，陳銀芳，碩士論文，江南大學(xué)，2009年)。又例如埃希氏桿菌屬菌 株，尤其是大腸桿菌co/i)(-株產(chǎn)L-賴氨酸的菌株及其生產(chǎn)L-賴氨酸的 方法，【申請?zhí)枴緾N201310285525. X)。
[0015] 另外，作為培養(yǎng)上述產(chǎn)賴氨酸微生物的方法，沒有特別限制，可采用公知的方法。 更具體而言，例如，當(dāng)培養(yǎng)微生物時，作為培養(yǎng)基，可使用含有碳源、氮源及無機(jī)離子的培養(yǎng) 基。
[0016]例如碳源為可發(fā)酵性糖，包括但不限于葡萄糖、糖蜜、乳糖、木糖、果糖、蔗糖等。優(yōu) 選葡萄糖、蔗糖和糖蜜等作為碳源。上述碳源可單獨(dú)使用或并用兩種以上。
[0017] 作為氮源，可舉出例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無機(jī)銨鹽；例如大豆水解物、毛發(fā) 水解液等有機(jī)氮源。上述氮源可單獨(dú)使用或并用兩種以上。
[0018] 作為無機(jī)離子，可舉出例如鈉離子、鎂離子、鉀離子、錳離子、鐵離子、磷酸根離子、 硫酸根離子等。培養(yǎng)基中可添加一種或多種上述無機(jī)離子。
[0019] 作為上述培養(yǎng)基，更具體而言，可舉出如LB培養(yǎng)基，例如包含葡萄糖2%~10%， 糖蜜0. 5%~1. 5%，玉米漿0. 3%~1. 2%，硫酸銨0. 2%~0. 8%，磷酸氫二鉀0. 5%~2. 5%， 七水合硫酸鎂〇. 04%~0. 10%，七水合硫酸鐵0. 001%~0. 003%，四水合硫酸錳0. 001%~ 0.003% (以培養(yǎng)基的重量為基準(zhǔn)）的發(fā)酵培養(yǎng)基接入具有賴氨酸生產(chǎn)能力的棒桿菌種子液 進(jìn)行發(fā)酵后獲得的發(fā)酵原液。
[0020] 作為培養(yǎng)條件，沒有特別限制，例如，當(dāng)培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌時時，在需氧條件下，培 養(yǎng)溫度例如為25~42 °C，優(yōu)選為28~38 °C;培養(yǎng)pH值例如為5.0~8. 5,優(yōu)選為5. 8~ 7. 3,更優(yōu)選為6. 8 ;培養(yǎng)時間例如為30~80小時，優(yōu)選為40~70小時；轉(zhuǎn)速300~600 轉(zhuǎn)/分鐘，通空氣量為〇. 4 vvm~1. Ovvm，優(yōu)選為0. 5 vvm~0. 8vvm。
[0021] 本發(fā)明中，賴氨酸發(fā)酵液中的賴氨酸含量（w/w)為1%~50%,更優(yōu)選5~20%。在 一個實施例中，賴氨酸發(fā)酵液中的賴氨酸含量為1%，為3%，為5%，為11%，為16%，為20%，為 45%，或為 50%。
[0022] 本發(fā)明中，賴氨酸發(fā)酵液可包含SO廣等無機(jī)離子，其中SO廣濃度不低于 0. 005mol/kg，在一個實施例中，S042_的濃度為0. 23mol/kg，一個實施例中，S042_的濃度為 0. 24mol/kg。以上濃度以賴氨酸發(fā)酵液的重量為基準(zhǔn)。
[0023] 本發(fā)明中，賴氨酸發(fā)酵液還包含糖和游離的NH4+，總糖含量不低于300ppm，游離的 NH 4+含量不低于0. 028 mol/kg。一個實施例中總糖含量為350ppm，一個實施例中NH4+含量 為0? 032 mol/kg ;-個實施例中總糖含量為400ppm，一個實施例中NH4+含量為0? 035 mol/ kg。以上濃度以賴氨酸發(fā)酵液的重量為基準(zhǔn)。
[0024] 本發(fā)明中所用的賴氨酸脫羧酶(簡稱LDC，EC4. 1. 1. 18)是可將賴氨酸轉(zhuǎn)化為1， 5_戊二胺的酶，沒有特別限制，可以來自公知的生物酶。更具體而言，賴氨酸脫羧酶可以 來自野生菌株，例如嗜堿芽孢桿菌（ifeciBys )、枯草芽孢桿菌（ifeciBtts subtills) (Escherichiaco7i) > M ? |if(Streptomycescoelicolor)> 毛鏈霉菌 哨蝕艾肯氏菌corroofe/751)、嗜氨基酸真 豐干菌{Eubacteriumacidaminophilum)> it ^ ^ H ￡￡ lif{Salmonellatyphimurium)> 蜂房哈夫尼菌a/Fei)、嗜酸熱原體深海熱球菌 或谷氨酸棒狀桿菌等；賴氨酸脫羧 酶也可以來自于基于上述菌株的誘導(dǎo)突變后的菌株、基因工程菌。
[0025] 基因工程方法中，作為重組細(xì)胞，沒有特別限制，可舉出來自微生物、動物、植物或 昆蟲的重組細(xì)胞。更具體而言，例如，當(dāng)使用動物時，可舉出小鼠、大鼠或其培養(yǎng)細(xì)胞等；另 外，當(dāng)使用植物時，可舉出例如擬南芥、煙草或其培養(yǎng)細(xì)胞等；另外，當(dāng)使用昆蟲時，可舉出 例如蠶或其培養(yǎng)細(xì)胞等，當(dāng)使用微生物時，可舉出例如大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌等。
[0026] 上述重組細(xì)胞可單獨(dú)使用或并用兩種以上。
[0027] 可以使用活性已經(jīng)提高的賴氨酸脫羧酶細(xì)胞。作為提高細(xì)胞賴氨酸脫羧酶活性的 方法，例如可以采用使賴氨酸脫羧酶的酶量增加的方法等。作為使細(xì)胞酶量增加的方法，可 舉出例如基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)領(lǐng)域的改良、基因拷貝數(shù)的增加、翻譯成蛋白的效率提高等。
[0028] 另外，作為培養(yǎng)上述重組細(xì)胞的方法，沒有特別限制，可采用公知的方法。更具體 而言，例如，當(dāng)培養(yǎng)微生物時，作為培養(yǎng)基，可使用含有碳源、氮源及無機(jī)離子的培養(yǎng)基。
[0029] 作為碳源，可舉出例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、麥芽糖、木糖、 海藻糖、核糖或淀粉的水解物等糖類；例如甘油、甘露醇或山梨糖醇等醇類；例如葡糖酸、 富馬酸、檸檬酸或琥珀酸等有機(jī)酸類等，優(yōu)選葡萄糖、蔗糖和淀粉水解物等作為碳源。上述 碳源可單獨(dú)使用或并用兩種以上。
[0030] 作為氮源，可舉出例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無機(jī)銨鹽；例如大豆水解物等有 機(jī)氮源。上述