一種丙型肝炎病毒一步法核酸定量/基因分型rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物檢測技術(shù)，尤其涉及一種用于丙型肝炎病 毒核酸的熒光定量檢測，同時(shí)對(duì)樣本進(jìn)行基因分型檢測的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起的，以肝臟損害的一組全身性傳染病。丙型肝 炎病毒（hepatitis C virus，HCV)是丙型病毒性肝炎的主要致病病毒。HCV基因組序列具 有高度變異性，根據(jù)不同區(qū)域的基因序列變異情況，HCV可分為1、2、3、4、5和6型等6個(gè)基 因型和80多種基因亞型。丙型肝炎病毒的遺傳多樣性對(duì)疾病進(jìn)程及藥物治療反應(yīng)性都有 很大影響。近年來的研究表明，HCV的基因型與丙型肝炎的治療方案及治療周期關(guān)系密切。
[0003] 目前，臨床上更多應(yīng)用干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療HCV。研究表明，不同基因型 HCV感染者在用a-干擾素聯(lián)合利巴韋林治療過程中所產(chǎn)生的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答（sustained virological response，SVR)比例有所不同：1、4、5和6型持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答比例為30%，2 和3型持續(xù)病毒性應(yīng)答比例為65%。且，1型HCV的體內(nèi)復(fù)制速度明顯高于其他基因型，lb 患者肝臟組織學(xué)分級(jí)、病程進(jìn)展速度也明顯高于2型。
[0004] 中國流行的HCV有1型、2型、3型和6型等4種基因型。2011年針對(duì)我國漢族CHC 病毒基因型和宿主基因型的橫斷面研究納入了 997例初治患者，結(jié)果顯示最主要的HCV基 因型為1型，占58. 4%，其中l(wèi)b亞型占所有基因型的56. 8%，表明在我國"難治性丙型肝 炎"占主導(dǎo)；2型次之（24. 1% )，之后為3型（9. 1% )、6型（6. 3% )和混合感染（2. 1% )， 未發(fā)現(xiàn)4型和5型。1型和2型在全國范圍廣泛分布，3型和6型主要見于南方和西南（如 云南、廣西壯族自治區(qū)、廣東、福建等），2種型加起來可占到這些地區(qū)基因型的40%左右。
[0005] 由此可見，HCV基因分型在HCV感染、傳播、診斷、診療、預(yù)防等方面均有重要意義， 可作為HCV感染的診斷和重要的預(yù)后指標(biāo)，有助于針對(duì)不同HCV基因型感染患者用藥劑量 及相關(guān)療程的監(jiān)測。結(jié)合HCV各基因型對(duì)干擾素治療所產(chǎn)生的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答的差異及其 在中國的流行態(tài)勢，區(qū)分HCV1型、2型和6型對(duì)丙型肝炎臨床診斷治療具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義。
[0006] 臨床上，丙型肝炎病毒（HCV)的診斷主要依賴實(shí)驗(yàn)室檢查。對(duì)HCV檢測診斷的主要 方法有：丙型肝炎病毒抗體（抗HCV)的檢測和多聚酶鏈法（PCR)檢測丙型肝炎病毒核糖核 酸（HCV-RNA)。在實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)中，放射免疫診斷（RIA)或酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA)是確診 HCV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但檢測的準(zhǔn)確率受方法學(xué)的靈敏度以及操作者的熟練程度、標(biāo)本質(zhì)量等 因素影響。
[0007] 當(dāng)前，基于TaqMan探針技術(shù)的熒光定量PCR是融匯了 PCR高敏感性、DNA雜交技 術(shù)高特異性和光譜技術(shù)高精確定量三大技術(shù)的一種新的檢測方法，該方法取材簡單，操作 方便，完全封閉式操作避免了檢測時(shí)的標(biāo)本被污染和對(duì)環(huán)境的污染，能簡便、微量、快速、高 特異、高敏感、定量、無污染地檢測丙型肝炎病毒，還可以以量化指標(biāo)來評(píng)估療效。因此，熒 光定量PCR法是臨床早期診斷HCV感染的最有價(jià)值的方法之一。
[0008] TaqMan探針技術(shù)是高度特異的熒光定量PCR技術(shù)。TaqMan探針是一種寡核苷酸 探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5' -末端，淬滅基團(tuán)在探針3' -末端。當(dāng)探針完整或與靶序 列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'-端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅，無熒光信號(hào)產(chǎn)生。在 進(jìn)行PCR反應(yīng)延伸過程時(shí)，TaqDNA聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性將探針降解，使得熒 光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。每經(jīng)歷一個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)，就有一分子的擴(kuò)增產(chǎn) 物生成，并伴隨著一分子的熒光信號(hào)的產(chǎn)生。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán) 信號(hào)不斷積累，為一個(gè)指數(shù)同步增長的過程，熒光信號(hào)的強(qiáng)度就代表了擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)。 該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)、有效解決了 PCR污染等問題。HCVRNA熒光定量 檢測正是基于這種原理設(shè)計(jì)，為HCV早期感染診斷、大規(guī)模篩查、療效動(dòng)態(tài)分析、新藥開發(fā) 等提供良好的技術(shù)支持。目前，國內(nèi)外已上市多種HCV定量檢測試劑和HCV分型檢測，而將 二者融合在一起進(jìn)行檢測的試劑盒尚未發(fā)現(xiàn)；本試劑盒的開發(fā)成型可填補(bǔ)該方面技術(shù)和產(chǎn) 品的空白。
[0009] 同時(shí)為避免反應(yīng)結(jié)果的假陽性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中用 dUTP代替dTTP，這樣僅在擴(kuò)增片段中含有dUTP ;而dUTP使污染的擴(kuò)增子在擴(kuò)增靶DNA前 易于被UNG酶降解：這種含有dUTP的PCR產(chǎn)物與UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶 堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可從單鏈或雙鏈DNA中消除dUTP而阻止Taq DNA聚合 酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG酶在50°C以上即失去活性，這樣經(jīng)過熱循環(huán)不會(huì) 破壞病人HCV RNA。UNG酶對(duì)不含dUTP的模板無任何影響，因此，反應(yīng)體系中只有從HCV陽 性病人樣本血清中提取的HCV RNA因不被UNG酶降解而直接進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
[0010] 而且，將人造的競爭性內(nèi)參RNA(慢病毒）引入反應(yīng)體系，以指示每個(gè)PCR反應(yīng)管 的擴(kuò)增情況，從而避免假陰性或部分抑制結(jié)果的出現(xiàn)。
[0011] 該技術(shù)通過對(duì)HCV各基因型序列比對(duì)分析，獲得分別針對(duì)HCV定量、HCV1型、2型 通用引物及各自特異性的熒光探針，通過檢測各種HCV標(biāo)準(zhǔn)血清及臨床血清，確定該試劑 盒的各種檢測指標(biāo)，確定該試劑盒檢測的特異性、靈敏度，為HCV的確診、大規(guī)模篩選、病情 程度判斷、療效評(píng)價(jià)、新藥開發(fā)等提供一個(gè)方便、廉價(jià)的檢測手段。其關(guān)鍵技術(shù)為獲得針對(duì) HCV定量通用引物、各種HCV1型、2型的通用引物及各自特異性的熒光探針，制備高特異 性、搞敏感性、重復(fù)性好的HCV核酸定量/基因分型RT-PCR檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的在于：提供一種精確簡便的用于丙型肝炎病毒RNA核酸定量，同時(shí) 對(duì)樣本進(jìn)行基因分型檢測的方法；另一目的在于提供一種用于該方法的試劑盒。
[0013] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種丙型肝炎病毒核酸定量和基因分型檢測方法及試 劑盒，采用一步法RT-PCR技術(shù)對(duì)丙型肝炎病毒RNA進(jìn)行核酸定量及基因分型檢測。在使用 上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的磁珠法純化試劑對(duì)HCV陽性血清樣本進(jìn)行核酸提 取后，直接配制反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系配制方便，擴(kuò)增程序步驟簡便，擴(kuò)增時(shí)間短，無 需多次重復(fù)循環(huán)、防止產(chǎn)物污染。本發(fā)明方法操作簡便、敏感度高、結(jié)果明晰、可靠性高。
[0014] 本發(fā)明提供的試劑盒包括：RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR酶混合物、HCV定量/分型引物 探針、內(nèi)參、陰性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、強(qiáng)陽性對(duì)照、校準(zhǔn)品1號(hào)~5號(hào)。其中，所述的RT-PCR 反應(yīng)液為 Tris-HCl (pH8. 3) 20mM、KCllOOmM、明膠 0? 2mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0. 4mM、MgC126mM的混合液；所述的酶混合物為逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶的混合物 (逆轉(zhuǎn)錄酶3U / iil，Taq DNA聚合酶2U / iil，UNG酶1U / ill);所述的HCV定量/分 型引物探針為一對(duì)HCV定量特異性引物、一對(duì)HCV基因分型特異性引物、一條HCV定量特異 性探針、一條HCV1型特異性探針、一條HCV2型特異性探針和一條內(nèi)參特異性探針的混合液 (引物各6. 25uM，HCV定量特異性探針2. 5uM，HCV1型特異性探針2. 5uM，HCV2型特異性探 針2. 5uM和內(nèi)參特異性探針2. 5uM);所述的內(nèi)參為含有與內(nèi)參基因序列相同的特定基因片 段的慢病毒的人血清；所述的陰性對(duì)照為無HCV RNA的正常人血清；所述的臨界陽性對(duì)照 為含有1型和2型HCV基因片段的慢病毒的人血清；所述的強(qiáng)陽性對(duì)照為含有1型HCV基 因片段的慢病毒的人血清；所述的校準(zhǔn)品1號(hào)~5號(hào)為已知濃度梯度的含有HCV基因片段 的慢病毒的人血清。檢測用的HCV RNA定量特異性通用擴(kuò)增引物分上游引物和下游引物，
[0015] 上游引物序列〈SEQ ID No. 5〉為：5' -GACGTCTACATTGGCCATGGCG-3'
[0016] 下游引物序列〈SEQ ID No. 6〉為：5'-TGGTCTGTCGGAGCAACACCG-3'
[0017] HCV RNA基因分型特異性通用擴(kuò)增引物分上游引物和下游引物，
[0018] 上游引物序列〈SEQ ID No. 7〉為：5' -CAITGCTTCCAITGATGGCTTA-3'
[0019] 下游引物序列〈SEQ ID No. 8〉為：5'-ITTGATCTTCRGCAGCGCACG-3'
[0020] HCV定量特異性探針序列〈SEQ ID No. 9〉為：
[0021] 5'-FAM-CAGTATGAGTGTCTCCAGGGACGGGA-BHQ-3 '
[0022] HCV1型特異性探針序列〈SEQ ID No. 10〉為：
[0023] 5'-HEX-ATAATATCAGTAGCAACCCTCTATTG-BHQ-3'
[0024] HCV2型特異性探針序列〈SEQ ID No. 11〉為：
[0025] 5'-CY3-TTAATATCARTAGCAACCCTCTGGTG-BHQ-3'
[0026] 內(nèi)參特異性探針序列〈SEQ ID No. 12〉為：
[0027] 5'-CY5-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTGCAC-BHQ-3'
[0028] 本發(fā)明提供的試劑保存于-20°C，凍融次數(shù)應(yīng)小于3次。
[0029] 本發(fā)明試劑盒使用方法：
[0030] 每次檢測均應(yīng)設(shè)立陰性對(duì)照、臨界陽性對(duì)照、強(qiáng)陽性對(duì)照、校準(zhǔn)品1號(hào)~5號(hào)。擴(kuò) 增檢測方法如下：
[0031] a、按反應(yīng)樣本數(shù)（反應(yīng)樣本數(shù)=待檢樣品數(shù)+對(duì)照品8個(gè)+l)n配制反應(yīng)液：取 RT-PCR反應(yīng)液n X 25 ill、HCV定量/分型引物探針n X 4 ill、RT-PCR酶混合物n X 1 ill于 一離心管中混勻；低速離心數(shù)秒，按30 yl /管分裝到反應(yīng)管中；
[0032] b、取樣本提取物、對(duì)照品提取物各20iU分別加入反應(yīng)管中，低速離心數(shù)秒，取出 置全自動(dòng)熒光PCR儀上；
[0033] c、反應(yīng)程序?yàn)椋?7°C反應(yīng)10min，50°C反應(yīng)15min，然后95°C保溫2min，再按 94°C 10s - 60°C 45s，循環(huán)45次，并于60°C分別采集FAM、HEX、CY3和CY5熒光通道的信 號(hào)；
[0034]d、儀器PCR程序運(yùn)行完成后按儀器及軟件要求進(jìn)行結(jié)果保存和數(shù)據(jù)分析。以取高 于樣本噪聲線和陰性對(duì)照的熒光值作為檢測閾值。在四通道（FAM、HEX、CY3和CY5)下檢測 反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度：
[0035] ①當(dāng)CY5通道檢