一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫探針法檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因植物品種的檢測試劑盒及其檢測方法，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫探針法檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自轉(zhuǎn)基因作物投入商業(yè)化種植來，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積累計(jì)已經(jīng)超過10億公頃。2010年，全球29個(gè)國家的1540萬農(nóng)民種植了共1.48億公頃的轉(zhuǎn)基因作物。自1996年至2010年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了 87倍。種植轉(zhuǎn)基因作物排名前十位的國家種植面積首次均超過了 100萬公頃。目前，世界各國已進(jìn)行田間試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因作物超過5000種，批準(zhǔn)商品化的轉(zhuǎn)基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、木瓜、甜菜、煙草、水稻等。從世界范圍看，轉(zhuǎn)基因的推廣已經(jīng)帶來了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。然而轉(zhuǎn)基因糧食在帶來巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也存在許多問題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性以及對生態(tài)環(huán)境的安全性方面，包括對人和動(dòng)物健康的風(fēng)險(xiǎn)，對生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)，對非目標(biāo)生物的風(fēng)險(xiǎn)。近來在全球范圍內(nèi)引起場轉(zhuǎn)基因生物安全性的爭論，支持和反對兩派爭鋒相對，勢不兩立，為便于消費(fèi)者區(qū)分及選購，各國分別提出對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識管理，并對最低含量作出規(guī)定。因此建立快速有效的檢測方法體系，對作物及食品進(jìn)行區(qū)分尤為重要。
[0003]目前轉(zhuǎn)基因作物的檢測主要是檢測樣品是否含有外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)產(chǎn)物)和是否含有外源基因(DNA)。轉(zhuǎn)基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試紙條檢測、Western雜交等方法檢測，但是這種方法要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，只能作為輔助檢測手段，另因檢測靶標(biāo)是蛋白，經(jīng)深加工的食品蛋白已發(fā)生變性，故外源蛋白質(zhì)檢測方法對于深加工的食品檢測具有一定局限性。轉(zhuǎn)基因作物的核酸檢測方法主要有PCR檢測技術(shù)、恒溫檢測技術(shù)。然而PCR檢測技術(shù)存在如下問題，1)PCR方法反應(yīng)體系和操作過程比較復(fù)雜，需要專業(yè)人員；2)所需PCR儀價(jià)格昂貴，檢測時(shí)間長；3)電泳常用染料EB為強(qiáng)致癌物質(zhì)，有較強(qiáng)毒性，且難以實(shí)行現(xiàn)場檢測，所以PCR檢測技術(shù)在基層仍未得到推廣應(yīng)用。
[0004]恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)具有快速簡便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點(diǎn)，自建立來已得到廣泛的應(yīng)用，并在原基礎(chǔ)上發(fā)展出采用SYBR Green染色法、鈣黃綠素法、濁度法、熒光染料法等不同結(jié)果伴讀方法，適合現(xiàn)場及快速檢測，已在基層得到推廣應(yīng)用，但所采用的SYBR Green染色法、鈣黃綠素法、濁度法、熒光染料法等在檢測原理上具有先天的不足，都以核酸擴(kuò)增產(chǎn)物或副產(chǎn)物為靶標(biāo)進(jìn)行直接檢測，如檢測中所發(fā)生的是非特異擴(kuò)增，檢測結(jié)果仍為陽性結(jié)果，即以上的測試方法存在檢測結(jié)果為假陽性的問題(特異性差的問題)，開發(fā)一種可避免假陽性的轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒是目前亟待解決的難題。
[0005]為避免假陽性擴(kuò)增，本發(fā)明在檢測引物組中引入特異性分子探針，該探針可實(shí)時(shí)與產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)生的靶標(biāo)片段特異性結(jié)合并發(fā)出熒光信號，如擴(kuò)增產(chǎn)物為非靶標(biāo)基因，該探針不與擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)合，無熒光信號發(fā)出，檢測結(jié)果仍為陰性。該檢測方法克服恒溫檢測技術(shù)的不足，將進(jìn)一步引領(lǐng)恒溫檢測技術(shù)的在檢測中的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫檢測試引物組。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫檢測方法。。
[0009]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫檢測引物組，包括外引物I和外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2、環(huán)引物和探針引物，其核苷酸序列分別如下所示:
外引物 1:5’ - ACGTAGTGCGTACCGCCGTGTG-3’ ；
外引物 2:5’ - GAATCGAGCTTGATCCAGAGTTC-3’ ；
內(nèi)引物1:
5’ - CCTGATATCTGTACAATGGCATTGAGGAGGCGTTGTACTGAGAACCATGCTGCG-3’ ；
內(nèi)引物 2:5，- GCCAGGCAAGTGTCGTTGCCTCATCTTCATCCCTGGACTTGC-3，；
環(huán)引物:5’ - GACGTTGCTGATTTCTGTTACAAAC-3’ ；
探針引物:FAM-AATTCTAGTGCAGATGCATGAATGAATT-BHQ-1。
[0010]一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫檢測試劑盒，其包括如上所述的恒溫檢測引物組。
[0011]所述試劑盒中還包括:DNA聚合酶、LAMP反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照。
[0012]所述LAMP反應(yīng)液包括1mM dNTP、150mM MgSOjK溶液，二者的體積比是7?9:2?4。
[0013]所述陽性對照為轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
[0014]一種轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的檢測方法，包括如下步驟:
(I)提取待檢樣品DNA。
[0015](2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng):利用權(quán)利要求1所述的恒溫檢測引物組對待檢樣品進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)將檢測管放置在可提供恒溫及熒光檢測的儀器上，每30?60s采集一次焚光信號；
恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系的25 μ I反應(yīng)體系含有:內(nèi)引物I 0.2 μ Μ，內(nèi)引物2 0.2 UMjF引物I 1.6 μΜ，外引物2 1.6 μΜ，環(huán)引物0.8 μΜ，探針引物0.8 μΜ，LAMP反應(yīng)液12.5 μ 1，DNA聚合酶8U，待檢樣品DNA 2 μ I，用超純水補(bǔ)齊到25 μ I ;
恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?60?63°C反應(yīng)20?60min。
[0016](3)結(jié)果判斷:根據(jù)有無“S”型擴(kuò)增曲線判斷陰陽性結(jié)果，有“S”型擴(kuò)增曲線為陽性結(jié)果，反之為陰性結(jié)果。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在引物組中引入特異性探針引物，可實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)的過程，并可有效降低假陽性的發(fā)生，該發(fā)明具有高特異性、高靈敏度、鑒定簡便、快速高效、操作簡便等有益效果:
(I)高特異性:本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處設(shè)計(jì)了 5條特異性引物，應(yīng)用上述5條引物，擴(kuò)增靶序列，具有很強(qiáng)的品系特異性，同時(shí)在引物體系中引入特異性探針引物，只有特異性探針引物與擴(kuò)增靶片段結(jié)合時(shí)才有熒光信號發(fā)出，儀器才判為陽性，有效的進(jìn)一步提高特異性，避免因形成引物二聚體及非靶標(biāo)基因擴(kuò)增造成的假陽性；
(2)快速高效:整個(gè)擴(kuò)增只用20?60min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)19?101(1個(gè)拷貝；
(3)操作簡便:擴(kuò)增完成后，無需電泳，開蓋加入熒光染料，儀器可根據(jù)熒光探針與擴(kuò)增靶標(biāo)結(jié)合發(fā)出的熒光信號自動(dòng)判讀檢測結(jié)果；
(4)尚靈敏度:最低檢測極限可達(dá)到0.01%。
【附圖說明】
[0018]圖1為實(shí)施例3靈敏度檢測圖；
圖2為實(shí)施例4特異性檢測圖；
圖3為實(shí)施例5實(shí)際樣品檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0020]實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫檢測試劑盒的建立轉(zhuǎn)基因水稻科豐6的恒溫檢測試劑盒，包括如下組分:
(I)LAMP檢測引物組，引物序列如下所示:
外引物 1:5’ - ACGTAGTGCGTACCGCCGTGTG-3’ (SEQ ID N0.1)；
外引物 2:5’ - GAATCGAGCTTGATCCAGAGTTC-3’ (SEQ ID N0.2)；
內(nèi)引物1:
5’ - CCTGATATCTGTACAATGGCATTGAGGAGGCGTTGTACTGAGAAC