采用膜過濾法從中國林蛙皮中分離提取透明質酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分離提取透明質酸的方法領域，特別是涉及到一種采用膜過濾法從中國林蛙皮中分離提取透明質酸的方法。
【背景技術】
[0002]透明質酸(Hyaluronic acid簡稱HA)是一種國際上公認的生物大分子保濕劑，它是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖(1-4)-D-D-葡萄糖醛酸雙糖重復單位所組成的直鏈粘多糖。經(jīng)過多年的研宄，人們對HA的結構、理化性質及生理功能已有了明確的認識，明確了它具有高度粘彈性、可塑性、滲透性和良好的生物相容性等諸多優(yōu)點。目前，HA被主要用于眼科顯微手術、關節(jié)炎治療、高級化妝品、婦產科等領域。天然的透明質酸，分子量在450，000?4，500, 000道爾頓范圍內。人工所得產品平均分子量在2，000, 000?2，500，000道爾頓之間。蛋白質是由許多氨基酸通過肽鍵相連而成的。分子量一般為數(shù)萬至數(shù)十萬。
[0003]國內外對透明質酸的研宄一般都只注重產品開發(fā)，而不注重對生產工藝的改進。目前，制備HA主要有兩種方法，一種是從雞冠、人臍帶、動物眼球等動物組織中獲得，制得的HA分子量較高，粘度好，保濕性好，但由于受原料資源的限制，不能滿足市場對HA的需求；另一種是微生物發(fā)酵生產法，是從某些菌屬的細菌的英膜中提取HA，其分離、純化工藝簡單，成本低，是今后的發(fā)展方向，但國內還處于研宄階段沒有成型的工藝，組織提取法仍是目前的主要生產方法。
[0004]林娃(Ranatempoviductus ranaearia chensinensis david)，是一種珍貴的兩棲類藥用經(jīng)濟動物。具有很高的藥用價值。人們對林蛙油的需求連年增長，林蛙養(yǎng)殖業(yè)飛速發(fā)展，僅就長白山地區(qū)每年可回捕林蛙3億只以上。因此，從林蛙皮中提取透明質酸具有極大的優(yōu)勢，將顯著提高我省林蛙產業(yè)的經(jīng)濟效益。非專利文獻1:沙坤，中國林蛙皮透明質酸提取技術的研宄[D]，2004.中提到對林蛙皮HA的制備工藝:1、確定了原料預處理方法，即在低溫條件下，對林蛙皮進行高速組織破碎；2、確定了最佳提取工藝，即采用復合酶法提取HA ;3、確定了最佳純化工藝，即采用鏈霉蛋白酶二次酶解、絡合沉淀和超濾結合的方法，對HA中間品進行純化處理，制得了高純度的HA精品。該文獻中采用的過濾介質是孔徑為0.088?0.074mm的尼龍濾布，并且該文獻中使用的溶劑中含有有機溶劑。孔徑為0.088?0.074mm的尼龍濾布，無法有效的去除蛋白，截留透明質酸；溶劑中含有有機溶劑也會造成試劑殘留問題，使安全性降低。如今，人們已經(jīng)逐漸認識到采用膜過濾等現(xiàn)代生物分離手段和方法制備HA，能有效解決上述問題，但目前卻沒有提出具體的方法和步驟。
[0005]因此現(xiàn)有技術當中亟需要一種新型的技術方案來解決這一問題。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是:本發(fā)明利用膜過濾等現(xiàn)代生物分離手段和方法制備HA精品，本發(fā)明選擇膜孔為500nm的陶瓷膜，該陶瓷膜可截留分子量為1，000, 000道爾頓，可以有效的去除蛋白，截留透明質酸。
[0007]采用膜過濾法從中國林蛙皮中分離提取透明質酸的方法，其特征是:包括以下步驟
[0008]步驟一、選取取油后在_2°C或者_2°C以下冷凍保存的中國林蛙皮1000克，放入玻璃容器中，加中國林蛙皮10倍量的水浸泡20小時?28小時；
[0009]步驟二、將步驟一浸泡后的中國林蛙皮及其溶液全部注入高速組織搗碎機，以10000轉/分鐘?14000轉/分鐘的轉速勻漿2分鐘?3分鐘，勻漿后成糊狀；
[0010]步驟三、將步驟二得到的糊狀物全部注入恒溫磁力攪拌器中，攪拌加熱至85°C?95°C后，保溫5分鐘?15分鐘，冷卻至45°C?55°C并保溫、自溶12小時；
[0011 ] 步驟四、將步驟三得到的糊狀物全部注入離心機中，以4000轉/分鐘離心，得到離心后的溶液和離心后的殘渣；
[0012]步驟五、分別取離心后的殘渣2倍量的水，洗滌離心后的殘渣兩次，將洗滌后的溶液與離心后的溶液混合；
[0013]步驟六、取HCl滴入步驟五得到的溶液中，調PH值至1.7?3.3，用500nm孔徑的陶瓷膜過濾，得到過濾后的溶液和過濾后的殘渣；
[0014]步驟七、分別取過濾后的殘渣3倍量的水，洗滌過濾后的殘渣3次，并將洗滌后的水與過濾后的溶液混合，得到截留液；
[0015]步驟八、取NaOH溶液滴入步驟七得到的截留液中，調PH值至7.5?8.5，取每克含活性蛋白酶40mg?50mg的胃蛋白酶，40克?50克加入到堿性的截留液，保持溫度45°C?50°C，酶解小時8小時?12小時，得到酶解液；
[0016]步驟九、將步驟八得到的酶解液全部注入離心機中，以3600轉/分鐘離心，取上清液；
[0017]步驟十、取HCl滴入步驟九得到的上清液中，調PH值至1.7?3.3，用500nm孔徑的陶瓷膜過濾，得到過濾后的溶液和過濾后的殘渣；
[0018]步驟十一、分別取過濾后的殘渣3倍量的水，洗滌過濾后的殘渣10次，并將洗滌后的水與過濾后的溶液混合；
[0019]步驟十二、將步驟^^一得到的溶液，加入NaCl，使溶液中NaCl的濃度為0.1mol/L?lmol/L，滴入HCl調PH值至6.5，加入本溶液體積3倍的95%乙醇進行洗脫，靜置24小時，以3600轉/分鐘離心，于真空干燥箱中60°C干燥24小時，得到透明質酸HA粗品；
[0020]步驟十三、按照HA粗品與水的比例1:30向將步驟十二得到的HA粗品中加水，同時加入溶液體積3%的高嶺土，50°C加熱30分鐘，進行脫色，以3600轉/分鐘離心，得到離心后的溶液和離心后的殘渣；
[0021]步驟十四、按照離心后的殘渣與水的比例1:1，加水洗滌步驟十三得到的離心后的殘渣，將洗滌后的水以3600轉/分鐘離心，將離心后的水溶液與步驟十三得到的離心后的溶液混合，放置冷卻至0°C?4°C，加入三氯醋酸飽和溶液，使溶液中三氯醋酸濃度達到8%,靜置半小時后，以3600轉/分鐘離心，取上清液；
[0022]步驟十五、將步驟十四得到的上清液，加入NaCl，使溶液中NaCl的濃度為0.1mol/L?lmol/L，加入本溶液體積3倍的95%乙醇進行洗脫，靜置24小時，用布氏漏斗抽濾，得到的濾液依次用95%乙醇、無水乙醇各洗滌一次進行醇沉，得到透明質酸HA精品。
[0023]所述步驟一、步驟五、步驟七、步驟十一和步驟十四中使用的水均為無菌蒸餾水。
[0024]通過上述設計方案，本發(fā)明可以帶來如下有益效果:
[0025]1、取油后冷凍保存的中國林蛙皮提取出來的透明質酸產品葡糖醛酸含量較高，能達到36%以上，而取油后風干保存的中國林蛙皮，用本工藝也可以提出相同質量的白色粉末，測定葡糖醛酸含量僅6%。
[0026]2、用本發(fā)明提取林蛙皮中的透明質酸，每千克林蛙皮可提取2.8克透明質酸精品，產品經(jīng)檢驗葡糖醛酸含量為36 %，蛋白質含量為0.58 %，達到化妝品級。
[0027]3、本發(fā)明采用膜過濾的方法除蛋白，對HA進行脫鹽、分級和濃縮，收率高、極少破壞多糖的生物活性，又沒有傳統(tǒng)有機溶劑法的試劑殘留問題，是一條經(jīng)濟、簡便、有效的提取工藝，適合于工業(yè)化生產HA。
【附圖說明】
[0028]以下結合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明:
[0029]圖1為本發(fā)明采用膜過濾法從中國林蛙皮中分離提取透明質酸的方法的流程框圖。
【具體實施方式】
[0030]實施例1、選擇取油后的中國林蛙皮，中國林蛙皮含脂肪量較低，容易絞碎，因此，直接加中國林蛙皮8倍量水浸泡20小時。以10000轉/分鐘的轉速勻漿2分鐘，勻漿后成糊狀，攪拌加熱至85°C，保溫5min，冷卻至45°C，自溶12小時，4000轉/分鐘離心，4倍量水，