牦牛乳乳清蛋白具有抗氧化活性的三肽及其應(yīng)用和組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及功能乳品技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及牦牛乳乳清蛋白具有抗氧化活性的三肽 及其應(yīng)用和組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體正常的氧化還原平衡被破壞，產(chǎn)生越來(lái)越多的活性氧 (R0S),脂類(lèi)、蛋白質(zhì)和DNA就會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體的損傷進(jìn)而加速衰老、引起如糖尿 病、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生。近年來(lái)，這些疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷上升 的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)膳食供應(yīng)來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力是降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平的一 種現(xiàn)實(shí)可行的方法，可以消除一些衰老所帶來(lái)的負(fù)面影響。相較于合成的抗氧化劑，如BHT、 BHA、沒(méi)食子酸丙酯等，抗氧化肽安全性高，毒副作用小，有些還具有多重生物活性，增強(qiáng)其 生理功能，更進(jìn)一步降低疾病發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)。抗氧化肽是一類(lèi)具有抗氧化活性的多肽物 質(zhì)，通常2-20個(gè)氨基酸。這些多肽的氨基酸序列和長(zhǎng)度各不相同，但是具有類(lèi)似的活性，大 多通過(guò)減緩或者終止氧化過(guò)程中的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來(lái)發(fā)揮作用。
[0003] 近年來(lái)，抗氧化肽越來(lái)越受到關(guān)注，目前已從乳蛋白、大豆蛋白和海洋生物等不同 來(lái)源的食源性蛋白質(zhì)水解分離得到具有良好抗氧化活性的肽段。其中，一些從乳清蛋白水 解得到的肽段在體外實(shí)驗(yàn)中活性可以達(dá)到甚至超過(guò)了合成抗氧化劑BHT、BHA，是良好的抗 氧化肽的來(lái)源(劉志東，郭本恒，王蔭榆，蔣士龍，李云飛.乳源抗氧化肽的研究進(jìn)展 [J] ?食品科學(xué)，2009, 30(01) : 282-286.)。
[0004] 乳清蛋白是乳沉淀酪蛋白后分離出來(lái)的蛋白質(zhì)，它具有很高的生物利用價(jià)值，富 含多種必需氨基酸，是國(guó)際上公認(rèn)優(yōu)質(zhì)的人體蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑之一。乳清蛋白主要存在于乳 清中，是利用牦牛乳生產(chǎn)曲拉及干酪素過(guò)程中的副產(chǎn)物。如果可以將其有效利用，既可以解 決乳清對(duì)環(huán)境的污染又能夠使其中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到充分的利用。利用我國(guó)特有的牦牛乳蛋白 資源，研究及開(kāi)發(fā)具有抗氧化生物活性肽，對(duì)拓展乳功能性食品及新藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，增進(jìn)乳的 開(kāi)發(fā)與利用價(jià)值，有一定的理論指導(dǎo)意義，對(duì)人類(lèi)健康事業(yè)的發(fā)展具有較大的促進(jìn)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供具有抗氧化活性的三肽及其多肽衍生物，該三肽具有較高的 抗氧化活性并能應(yīng)用于抗氧化功能食品、保健品及藥品中。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)牦牛乳乳清蛋白活性肽進(jìn)行了長(zhǎng)期系統(tǒng)性研究，發(fā)現(xiàn)源自乳源 蛋白的某些未報(bào)道具有抗氧化活性的三肽有與谷胱甘肽相近的抗氧化活性，由此完成了本 發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 本發(fā)明提供的具有抗氧化活性的三肽氨基酸序列為GTW、CQC、LFC、或QKW。
[0008] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的三肽氨基酸序列為GTW或CQC。
[0009] 進(jìn)一步的，所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的多肽衍生物，所述多肽衍生物為 所述抗氧化三肽的氨基酸被氨基化、或環(huán)化、或L-型氨基酸變?yōu)镈-型氨基酸。
[0010] 一種牦牛乳乳清蛋白抗氧化肽組合物，所述抗氧化肽組合物為抗氧化三肽GTW、 CQC、LFC和QKW中兩種或幾種的混合物。
[0011] 所述的牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的制備方法，從天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中 分離純化，或人工合成方法得到。
[0012] 進(jìn)一步的，所述從天然牦牛乳乳清蛋白酶解物中分離純化的方法包括以下步驟： 牦牛乳經(jīng)過(guò)脫脂、酸凝沉淀得到上清，將上清液用1M NaOH調(diào)節(jié)pH值5. 2,加熱溫度達(dá) 80-90°C，得到沉淀即為乳清蛋白。
[0013] 步驟1 :將新鮮的牦牛乳高速離心，6000rpm 20min，除去脂肪，得到脫脂乳。
[0014] 步驟2 :將所得脫脂乳在35-50°C范圍內(nèi)的恒溫水浴箱中進(jìn)行保溫，采用磁力加熱 攪拌器進(jìn)行攪拌，邊攪拌邊滴加1M HC1溶液，使脫脂乳溶液的pH達(dá)到4. 6,使酪蛋白進(jìn)行沉 淀，6000 rpm離心20 min后，得到上清液。
[0015] 步驟3 :將上清液用采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，邊攪拌邊滴加1M NaOH調(diào)節(jié)pH值 5. 2,再加熱至80-90 °C，使乳清蛋白沉淀，6000 rpm離心20 min后，得沉淀的乳清蛋白，將 其冷凍干燥24 h后得到牦牛乳乳清蛋白的凍干粉。
[0016] 步驟4 :將上述步驟所得乳清蛋白凍干粉溶于0. 05mol/L NaOH溶液中制成質(zhì)量濃 度為5 %的乳清蛋白溶液，用中性蛋白酶進(jìn)行水解反應(yīng)，酶與乳清蛋白的比為1800 U/g，用 恒溫水浴箱及1 M NaOH溶液分別調(diào)整酶解溫度為45 °C和pH值為7. 0,水解3h。
[0017]步驟5:將步驟4所得酶解液調(diào)節(jié)其pH值至4. 2,4200 rpm條件下離心20 min，取 上清液調(diào)節(jié)pH值至7.0。
[0018] 步驟6 :對(duì)步驟5所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行二級(jí)超濾。采用超濾杯設(shè)備，板式膜組件，先后 采用分子截留量分別為l〇KDa、6KDa親水性聚醚砜膜，進(jìn)行二級(jí)超濾：乳清蛋白降血壓多肽 濃度5 %，溶液pH 7.0,操作壓力0.15 MPa，溫度45°C。初步得到具有抗氧化活性的濾液。
[0019] 步驟7 :將步驟6所述超濾膜濾過(guò)液的多肽組分進(jìn)一步分離分析其活性功能組分， 樣品經(jīng)S印hadexG-25凝膠層析柱分離，多肽中的組分按分子量大小依次分離，按分離峰的 時(shí)間范圍收集洗脫液，并分別冷凍干燥保存。
[0020] 步驟8 :將步驟7所述各組分配置成0. 5 mg/mL的多肽溶液，測(cè)定ACE抑制活性值， 最高為77. 47±1. 12 %。將所得抑制活性高的組分采用半制備反相液相色譜柱進(jìn)一步分離。 多次重復(fù)操作，收集洗脫液，將有機(jī)溶劑揮發(fā)后冷凍干燥。
[0021] 步驟9 :將步驟8中得到的各組分配置相同濃度的溶液測(cè)定其ACE抑制率。將ACE 抑制率均大于70 %的組分進(jìn)行液質(zhì)分析，然后利用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)一級(jí)質(zhì)譜中的肽段氨基酸序 列進(jìn)行了分析，得到以上三條多肽序列。
[0022] 進(jìn)一步的，所述牦牛乳乳清蛋白抗氧化三肽的人工合成方法包括以下步驟： (1) Fmoc固相合成過(guò)程 采用Fmoc固相合成法的原理、步驟和操作條件，依次合成GTW、CQC、LFC、或QKW ; (2) 三肽的純化 采用半制備型反相高效液相色譜在以下條件下純化步驟（1)中合成的三肽；用島津 (LC-10A)液相色譜儀，采用BECKMAN C18制備柱，流動(dòng)相A :0. 1%三氟乙酸（TFA)/超純水； 流動(dòng)相B :0. 1%TFA/乙腈；梯度程序：5%_50%B 30min，流速5mL/min，上樣量3mL，采用230nm 波長(zhǎng)檢出流出峰并收集，真空冷凍干燥