一種支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 支原體是一種比較特殊的微生物，固體培養(yǎng)很困難，即使生長，其菌落也要借助倒 置顯微鏡才能看清楚，又由于支原體的液體培養(yǎng)物是完全透明的，要靠其生長過程中的代 謝產(chǎn)物改變液體培養(yǎng)基的pH值，并通過培養(yǎng)基中指示劑的顏色變化來判斷支原體的生長 情況。其中藥藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定比較困難，一般采用以下方法：微量稀釋培養(yǎng)法：96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板中，先用新鮮的液體培養(yǎng)基將藥液遞倍稀釋，共10個(gè)稀釋度，再往各孔加入等量 的菌液，同時(shí)設(shè)陽性、陰性對照，37°C培養(yǎng)，直至陽性對照孔發(fā)生顏色改變。以最低無顏色變 化的孔的藥物濃度定為最小抑菌濃度。但由于有些中藥煎劑的色澤較深，如魚腥草等，在藥 物稀釋度較低時(shí)，仍使培養(yǎng)基染上顏色，往往影響肉眼觀察，難以判斷指示劑的色澤改變， 可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差。顏色較深的中藥，有的在其中加入活性炭進(jìn)行吸附，可以降低顏 色的深度，但懷疑會(huì)吸附掉一部分有效成分，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顏色深又需要準(zhǔn)確抑菌濃 度時(shí)，有的人采取：對懷疑的抑菌濃度，從中取出一定量培養(yǎng)物，加入到新鮮的液體培養(yǎng)基 中重新培養(yǎng)一定的時(shí)間，看是否有支原體生長，來判定此濃度此濃度的抑菌效果。此方法費(fèi) 時(shí)費(fèi)力。雞毒支原體的MIC檢測就出現(xiàn)了這一問題，雞毒支原體是引起禽慢性呼吸道疾病 的病原體之一，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失并影響產(chǎn)品質(zhì)量。為了提高治療效果和解決 臨床西藥藥殘問題，體外篩選中藥作為治療藥物。但因?yàn)橹兴幩幰旱纳珴奢^深和雞毒支原 體的生長特點(diǎn)，傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)很難準(zhǔn)確觀察到檢測液變色的臨界點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，對傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)方 法進(jìn)行改進(jìn)，利用其生長過程中的代謝產(chǎn)物改變培養(yǎng)基的pH值這一點(diǎn)，發(fā)明新方法，用pH 計(jì)檢測支原體培養(yǎng)物的pH值，通過pH值的高低來判定中藥對支原體的最低抑菌濃度，提供 一種支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法包括以下步驟：
[0005] 步驟1):取目標(biāo)中藥，將所述目標(biāo)中藥通過煎煮、濃縮為0. 5g/mL的藥液，高壓滅 菌；對待檢支原體培養(yǎng)物進(jìn)行復(fù)蘇，并準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基；
[0006] 步驟2):取12支長度為7cm、半徑為1. 5cm的玻璃試管，滅菌后依次編號為"（-)、 ①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、（+)"，放入合適的試管架上；
[0007] 步驟3):向㈠試管中加入2mL步驟1)所述液體培養(yǎng)液；向①、②、③、④、⑤、⑥、 ⑦、⑧、⑨、⑩、（+) 11支試管中各加lmL步驟1)所述液體培養(yǎng)液；
[0008] 步驟4):向①試管中加入lmL步驟1)所述藥液，將①試管中藥液與液體培養(yǎng)液用 移液器充分混勻，然后遞倍稀釋至第⑩管；
[0009] 步驟5):向①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、（+) 11支試管中，各加人0.8mL液體 培養(yǎng)液和0. 2mL菌液的混合液；
[0010] 步驟6):將12支試管塞緊膠塞，在無光條件下于37°C恒溫箱中培養(yǎng)7~15天培 養(yǎng)；通過pH計(jì)來測定各管內(nèi)培養(yǎng)物的pH值；
[0011] 步驟7):將經(jīng)步驟6)處理的12支試管，通過精密pH計(jì)來測定（-)、①~⑩、（+) 管內(nèi)培養(yǎng)物的pH值，取依次記錄數(shù)據(jù)；
[0012] ①~⑩試管數(shù)據(jù)為一先升后降的pH變化趨勢，找到其下降階段數(shù)據(jù)中，第一個(gè)與 (_)試管數(shù)據(jù)差值大于等于-1的試管，該試管的前一試管中的藥物濃度，即為最低抑菌濃 度。
[0013] 作為進(jìn)一步說明，步驟1)所述的待檢支原體培養(yǎng)物復(fù)蘇方法為，將凍存的支原體 菌種融化后，按一定質(zhì)量比1:9比例加到新鮮的培養(yǎng)液中，于37°C培養(yǎng)，即可復(fù)蘇支原體。
[0014] 作為進(jìn)一步說明，步驟1)所述的液體培養(yǎng)基為改良Freg氏液體培養(yǎng)基，其原料配 方為，NaCl-5. 0g、KCl-0? 4g、MgS04. 7H20-0? 2g、Na2HP04. 12H20-1. 6g、KH2P04-0? 2g、葡 萄糖一 l〇g、乳蛋白水解物一 5g、酵母粉一 5g、l %半胱氨酸溶液一 10mL、2 %精氨酸溶液一 20mL、豬血清一 100mL、1 %粉紅溶液一 1. OmL、10萬單位/mL青霉素一 10mL、1 %醋酸托溶 液一 10mL ;稱取上述各成分，加水至1000mL用1. 0 % mol/L的NaOH調(diào)pH值至7. 6~7. 8， 0.22um孔徑篩濾、除菌、分裝，-20°C保存。
[0015] 作為進(jìn)一步說明，步驟4)所述遞倍稀釋具體操作為，將①試管中的液體培養(yǎng)液和 培養(yǎng)液用移液器充分混勻后，取lmL移入②試管，并與②試管中的液體培養(yǎng)液混勻，再從② 試管中取lmL移入③試管，以此類推至⑩試管，最后從?、庠嚬芑靹蛞褐腥mL棄掉。
[0016] 作為具體優(yōu)化，步驟1)所述中藥為大黃、桔梗、黃連。
[0017] 作為具體優(yōu)化，步驟1)所述支原體為雞毒支原體。
[0018] 作為具體優(yōu)化，步驟4)所述（_)、①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、（+) 12支試管 中的藥物濃度為分別為 0、125mg/mL、62. 5mg/mL、31. 25mg/mL、15. 625mg/mL、7. 8125mg/mL、 3. 9063mg/mL、l. 9531mg/mL、0. 9766mg/mL、0. 4883mg/mL、0. 2441mg/mL、0。
[0019] 本發(fā)明一種支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法，相對傳統(tǒng)方法操作更為簡單、 便捷，通過精密pH計(jì)配合數(shù)據(jù)處理方法，使顏色較深的中藥對支原體的最低抑菌濃度的判 斷更為方便、直觀、準(zhǔn)確，該方法尤其適用于顏色較深的中藥的支原體MIC檢測。
【附圖說明】
[0020] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明一種支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法作進(jìn)一步說 明：
[0021] 圖1是本支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法的實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；
[0022] 圖2是本支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法的實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；
[0023] 圖3是本支原體中藥最低抑菌濃度檢測新方法的實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1 :
[0025] 步驟1):取大黃，將大黃通過煎煮、濃縮為0. 5g/mL的藥液，高壓滅菌；對雞毒支 原體進(jìn)行復(fù)蘇，并準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基；所述雞毒支原體復(fù)蘇方法為，將凍存的雞毒支原體融化 后，按一定質(zhì)量比1:9比例加到新鮮的培養(yǎng)液中，于37°C培養(yǎng)，即可復(fù)蘇支原體。所述的液 體培養(yǎng)基為改良Freg氏液體培養(yǎng)基，其原料配方為，NaCl-5.Og、KCl一0. 4g、MgS04. 7H20- 0? 2g、Na2HP04. 12H20 - 1. 6g、KH2P04 - 0? 2g、葡萄糖一 10g、乳蛋白水解物一5g、酵母粉一5g、 1 %半胱氨酸溶液一 10mL、2 %精氨酸溶液一20mL、豬血清一 100mL、l%粉紅溶液一l.OmL、 10萬單位/mL青霉素一 10mL、1 %醋酸托溶液一 10mL;稱取上述各成分，加水至1000mL用 1. 0 %mol/L的NaOH調(diào)pH值至7. 6~7. 8,0. 22um孔徑篩濾、除菌、分裝，-20°C保存。
[0026] 步驟2):取12支長度為7cm、半徑為1. 5cm的玻璃試管，滅菌后依次編號為"（-)、 ①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、（+)"，放入合適的試管架上；
[0027] 步驟3):向㈠試管中加入2mL步驟1)所述液體培養(yǎng)液；向①、②、③、④、⑤、⑥、 ⑦、⑧、⑨、⑩、（+) 11支試管中各加lmL步驟1)所述液體培養(yǎng)液；
[0028] 步驟4):向①試管中加入lmL步驟1)所述藥液，將①試管中藥液與液體培養(yǎng)液用 移液器充分混勻，然后遞倍稀釋至第⑩管；所述遞倍稀釋具體操作為，將①試管中的液體培 養(yǎng)液和培養(yǎng)液用移液器充分混勻后，取lmL移入②試管，并與②試管中的液體培養(yǎng)液混勻， 再從②試管中取lmL移入③試管，以此類推至⑩試管，最后從?、庠嚬芑靹蛞褐腥mL棄 掉；
[0029] 步驟5):向①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、（+) 11支試管中，各加人0.8mL液體 培養(yǎng)液和〇. 2mL菌液的混合液；至此，所述（-)、①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩、（+) 12支 試管中的藥物濃度為分別為 〇、125mg/mL、62. 5mg/mL、31. 25mg/mL、15. 625mg/mL、7. 8125mg/ mL、3. 9063mg/mL、l. 9531mg/mL、0. 9766mg/mL、0. 4883mg/mL、0. 2441mg/mL、0。
[0030] 步驟6):將12支試管塞緊膠塞，在無光條件下于37°C恒溫箱中培養(yǎng)7~15天培 養(yǎng)；通過pH計(jì)來測定各管內(nèi)培養(yǎng)物的pH值；結(jié)果如圖1所示。
[0031] 步驟7):將經(jīng)步驟6)處理的12支試管，通過精密pH計(jì)來測定（-)、①~⑩、（+) 管內(nèi)培養(yǎng)物的pH值，取依次記錄數(shù)據(jù)；
[0032] ①~⑩試管數(shù)據(jù)為一先升后降的pH變化趨勢，找到其下降階段數(shù)據(jù)中，第一個(gè)與 (_)試管數(shù)據(jù)差值大于等于-1的試管，該試管的前一試管中的藥物濃度，即為最低抑菌濃 度。
[0033] 實(shí)施例2 :
[0034] 步驟1):取黃連，將黃連通過煎煮、濃縮為0. 5g/mL的藥液，高壓滅菌；對雞毒支 原體進(jìn)行復(fù)蘇，并準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基；所述雞毒支原體復(fù)蘇方法為，將凍存的雞毒支原體融化 后，按一定質(zhì)量比1:9比例加到新鮮的培養(yǎng)液中，于37°C培養(yǎng)，即可復(fù)蘇支原體。所述的液 體培養(yǎng)基為改良Freg氏液體培養(yǎng)基，其原料配方為，NaCl-5. 0g、KCl一0. 4g、MgS04. 7H20- 0? 2g、Na2HP04. 12H20 - 1. 6g、KH2P04 - 0? 2g、葡萄糖一 10g、乳蛋白水解物一5g