一種高效免疫活性細胞CpG-DCIK的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫活性細胞技術領域，特別涉及一種抗腫瘤免疫活性細胞CpG-DCIK的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002]惡性腫瘤是當前危害人類健康的主要疾病之一，在傳染病得到控制的國家，心腦血管疾病和惡性腫瘤已分別成為死亡原因的第一和第二位。2005年統(tǒng)計，我國城市居民死亡第一位是惡性腫瘤，是農村居民的第二位死因。
[0003]在腫瘤的治療方法中，免疫治療已經成為手術治療、化療和放療之外，最重要、最有希望的治療手段。在過去的20多年里，腫瘤特異性主動免疫治療和過繼性免疫治療兩個方面都有很大的發(fā)展。在腫瘤過繼免疫治療中，先后出現(xiàn)了五種引人注目的免疫效應細胞:淋巴因子誘導的殺傷細胞(LAK細胞)；腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL細胞)；抗白細胞分化抗原-3單克隆抗體(CD3單抗)和白細胞介素-2誘導的殺傷細胞(AK-T細胞)；細胞毒T淋巴細胞(CTL細胞)和細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)。LAK細胞增殖性能不理想和細胞毒活性較低且維持時間較短而漸被淘汰。CTL和TIL，從理論上看最被看好的免疫效應細胞，CTL但目前尚無有效的擴增手段，TIL來源受限。AK-T細胞和CIK細胞都是用抗CD3單抗為刺激因子激發(fā)T淋巴細胞增殖，具相同的增殖活性。CIK細胞還有賴于其他細胞因子的參與，故CIK比AK-T細胞有更強的細胞毒活性。但是，CIK和AK-T及LAK細胞一樣，也不具備特異性識別和殺傷腫瘤細胞的特性。
[0004]在眾多腫瘤腫瘤特異性免疫治療方法中，樹突狀細胞(DC)作為新一代疫苗的研宄和應用，成為近年來主動免疫治療研宄中的熱點，DC是已知的最主要的抗原提呈細胞，具有捕獲、加工處理抗原和向T淋巴細胞提呈抗原分子，表達共刺激分子，釋放細胞因子和白細胞介素等特性。因此，DC在腫瘤免疫應答中起主要免疫調節(jié)作用。
[0005]當DC與CIK共培養(yǎng)時，彼此能相互作用而誘導出比CIK細胞有更強增殖活性，更高的腫瘤細胞殺傷活性的細胞群。專利文獻(公開號為CN1431298A，公開日為2003年07月23日)公開了一種抗腫瘤免疫活性細胞-DCIK細胞的制備方法及應用，主要是利用細胞因子誘導DC和CIK細胞，然后用腫瘤抗原沖擊DC細胞，將經抗原沖擊過的DC與CIK細胞按一定比例混合進行共培養(yǎng)，得到一種新的免疫效應細胞群，即DCIK細胞，與CIK細胞比較，DCIK細胞的增殖活性和細胞毒活性更強，細胞毒性比CIK高出10-20%，且表現(xiàn)對惡性細胞的特異性殺傷，主要用于自體瘤治療，術后即時施治能有效防轉移防復發(fā)，也可作化學療法的輔助治療。但是上述專利文獻CN1431298A公開的技術方案也有一定的缺點和不足:腫瘤抗原沖擊的DCIK細胞的制備必須要經過手術等方法取得新鮮腫瘤組織標本來提取抗原，而臨床上相當部分病人喪失了手術機會，以及經過放化療后的病人也難于獲取腫瘤抗原。也就是說，腫瘤抗原來源有限，特別是經過放化療后的腫瘤患者。
[0006]近年來的研宄表明，細菌的CpG-ODN可以激活機體多種免疫細胞，誘生多種細胞因子，可以調節(jié)免疫應答向Thl型轉化，并且人工合成的CpG寡核苷酸(CpG-oIigodeoxynucleotides, CpG-ODN)也可模擬上述反應。CpG-ODN與抗原刺激的DC細胞共同注射到患結腸癌的鼠體內，可明顯提高DC的抗瘤活性，并且全身給藥抑制腫瘤生長能力比5-FU和甲酰四氫葉酸強，但是，CpG-ODN直接體內注射需要劑量較大而且連續(xù)注射一周有組織壞死，出血等副作用。也就是說，如果為誘導更強的免疫效果而大劑量注射CpG-ODN，將會產生較大的副作用。
[0007]因此，改善現(xiàn)有技術中抗腫瘤免疫效應細胞在增殖性能和細胞毒活性以及對腫瘤細胞特異性識別和攻擊活性的不足，從而開發(fā)出一種新的抗腫瘤免疫效應細胞，成為迫切的現(xiàn)實需要。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種高表達⑶3-⑶56、增殖活性高、釋放細胞因子量大、細胞毒活性高的高效免疫活性細胞CpG-DCIK的制備方法及應用。
[0009]本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn):
[0010]第一方面，本發(fā)明涉及一種高效免疫活性細胞CpG-DCIK的制備方法，包括以下步驟:先利用CpG及細胞因子誘導DC細胞，再用細胞因子誘導同源CIK細胞，然后將所述DC細胞與所述CIK細胞混合培養(yǎng)，即得:寡核苷酸誘導樹突細胞與細胞因子誘導殺傷細胞共培養(yǎng)細胞，定名為CpG-DCIK。
[0011 ] 本發(fā)明中，所述高效免疫活性細胞CpG-DCIK可以通過以下具體步驟獲得:
[0012]步驟(I)外周血單個核細胞(PBMC)的制備
[0013]取腫瘤病人抗凝外周血20-50ml，用生理鹽水對倍稀釋后，用比重為1.077的淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)，所述分離采用水平轉頭的離心機，離心的速度為2000rpm，離心的時間我20分鐘，然后用Hanks平衡液洗滌2_3次再進行顯微鏡下細胞計數，最后用淋巴細胞培養(yǎng)液調節(jié)細胞密度成3-5xl0_7ml的細胞懸液；
[0014]步驟⑵外周血淋巴細胞(PBL)和粘附細胞的分離
[0015]將步驟⑴所述細胞懸液移入6孔板，每孔3-5ml，置37°C、體積比5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中溫育2-3小時，然后用移液管沖洗細胞，將非黏附的細胞收集在50ml離心管中作為外周血淋巴細胞(PBL)懸液，6孔板留下的粘附細胞用于DC的誘導；
[0016]步驟⑶CIK細胞的誘導和擴增
[0017]在外周血淋巴細胞(PBL)懸液中添加重組人干擾素-γ，重組人干擾素-γ的終濃度為1000單位/暈升，然后移入表面積為75平方厘米的培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶裝量20暈升，置于37°C、體積比5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中溫育24小時，然后添加⑶3單抗、IL-1和IL-2，終濃度分別為50納克/毫升、100微克/毫升和800單位/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后，顯微鏡下細胞計數，然后用CIK培養(yǎng)液調解細胞濃度為3xl0_5/毫升，分配到75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20毫升，進行擴大培養(yǎng)，此后，每瓶48-72小時按上述相同條件擴大培養(yǎng)一次，培養(yǎng)至第8天收集CIK細胞待用；
[0018]步驟(4) DC的誘導和擴增
[0019]在步驟⑵中的留有粘附細胞的6孔板中，每孔加入含有重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的DC培養(yǎng)液3毫升，重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的終濃度分別是1000單位/毫升和500單位/毫升，然后置于37°C、體積比5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后在各孔中加入CpG-0DN2006，CpG-0DN2006的終濃度3微摩爾/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)至第5天，加入腫瘤壞死因子，腫瘤壞死因子的終濃度為100單位/毫升，培養(yǎng)至第8天，用移液管沖洗，收集非粘附和半粘附的DC待用；
[0020]步驟(5) DC與CIK細胞共培養(yǎng)制備CpG-DCIK細胞
[0021]將步驟(4)獲得的DC與步驟(3)獲得的CIK細胞分別計數，離心棄上清后，分別用CIK培養(yǎng)液調節(jié)細胞密度為6xl0_5/ml和2xl0_5/ml，再等體積混合后移入75平方厘米培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，每隔48-72小時按上述細胞密度分瓶擴大培養(yǎng)一次，即得CpG-DCIK細胞。
[0022]本發(fā)明中，所述淋巴細胞培養(yǎng)液可以采用完全F12/DMEM1:1、完全PRM1-1640或者完全AIM-V。
[0023]本發(fā)明中，所述CIK培養(yǎng)液可以采用含白細胞介素-1和白細胞介素-2的完全F12/DMEM1:1 或者 AM-V。
[0024]本發(fā)明中，所用移液管和離心管可以為聚丙稀材料(polypropylene), 6孔板和培養(yǎng)瓶可以為聚苯乙烯材料(polystyrene)。若改用其他規(guī)格培養(yǎng)器皿，應根據培養(yǎng)面積大小調整上述細胞懸液接種量。
[0025]第二方面，本發(fā)明還涉及上述高效免疫活性細胞CpG-DCIK在制備抗腫瘤藥物中的應用，較優(yōu)選在制備抗人體前列腺癌藥物中的應用。
[0026]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下:
[0027]本發(fā)明通過共培養(yǎng)得到的CpG-DCIK細胞與LAK、CIK細胞一樣為非均質細胞群，其主要生物學特性有:
[0028]1.細胞組成！CpG-DCIK細胞中T淋巴細胞占98%以上和少量DC，T淋巴細胞中個亞群所占比例具有個體差異和印體外培養(yǎng)時間長短而有一定變化范圍，一般為CD3+CD4+T細胞 20-40%，CD3+CD8+T 細胞 50-80%，CD3+CD56+T 細胞 20-60% ；
[0029]2.增殖活性高:CpG-DCIK細胞的增殖活性比同源DCIK和CIK細胞強大，體外擴增3周后，CpG-DCIK細胞比同源DCIK細胞和CIK細胞分別大1-1.5倍和4_8倍；
[0030]3.釋放細胞因子量大:CpG-DCIK細胞釋放IFN- γ的量是同源CIK細胞的3_6倍，是同源DCIK細胞的0.5-1倍；
[0031]4.細胞毒活性高:與同源CIK細胞比較CpG-DCIK細胞體外對特異靶細胞的殺傷作用高出20-30 %，略高于同源DCIK細胞，人癌動物模型治療試驗表明，CpG-DCIK細胞組動物的平均存活期是CIK組動物的3倍，是同源DCIK組動物的0.5倍。
[0032]因此，由于CpG-ODN能夠增強DC的抗原提呈能力，促進DC的功能成熟，同時DC與CIK共培養(yǎng)可以顯著提高CIK的增殖能力和細胞毒活性，故采用體外CpG-ODN聯(lián)合細胞因子誘導DC，然后與同源CIK共培養(yǎng)，以獲得增殖活性和細胞毒活性更強的免疫效應細胞群，而且Cp