一種針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚核苷酸及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制備領(lǐng)域，具體設(shè)及一種針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚 核巧酸及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM)是W骨髓中克隆性漿細(xì)胞惡性增殖為主要 特征的惡性腫瘤，MM多伴有復(fù)雜的染色體核型異常，基因組不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)染色體崎變與 MM患者疾病分期及預(yù)后緊密相連。Lionetti等依據(jù)遺傳學(xué)免疫球蛋白重鏈的易位和細(xì)胞 周期蛋白D，即TC(易位/細(xì)胞周期蛋白D)將匪患者分為T(mén)C1群[t(ll;14)和U6;14) 易位的患者]、TC2群（未發(fā)生易位但中低度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的患者）、TC3 (未劃分 到其他組的患者）TC4[t(4;14)易位的患者]和TC5[t(6;14)或t(14;20)易位的患者]5 類(lèi)。將近一半的MM患者是超二倍體伴有奇數(shù)染色體和染色體異位，如13號(hào)染色體缺失和 免疫球蛋白重鏈在14q32發(fā)生的染色體易位。
[0003] 研究表明染色體異常和其他類(lèi)型的遺傳或表觀遺傳改變可能導(dǎo)致癌癥中的miRNA 下調(diào)。在腫瘤中顯著過(guò)表達(dá)的miRNA可W作為一個(gè)新型的致癌基因，并稱(chēng)為"oncomiR"，該 些oncomiR通常通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)抑癌基因基因促進(jìn)腫瘤發(fā)生。因此，改變oncomiR的表達(dá)是一 種很有前途的癌癥治療策略。
[0004] miRNA在基因表達(dá)調(diào)控中扮演著重要的角色，參與生命過(guò)程中一系列的重要進(jìn)程， 包括細(xì)胞增殖分化和調(diào)亡，個(gè)體發(fā)育，機(jī)體代謝及免疫調(diào)節(jié)。miRNA能與祀mRNA的特異性結(jié) 合從而改變蛋白質(zhì)的表達(dá)，基于其作用機(jī)制miRNA既能發(fā)揮抑癌基因的作用也能起到致癌 基因的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種針對(duì)miR-99a 種子序列的微小反義寡聚核巧酸。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸 的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[000引一種針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸（tiny antimiR-99a， t-antimiR-99a)，其核巧酸序列如下；5' -TACGGGTT-3' ；
[0009] 所述的針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸經(jīng)過(guò)鎖核酸修飾；
[0010] 所述的針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用；
[0011] 所述的抗腫瘤藥物優(yōu)選為抗多發(fā)性骨髓瘤藥物；
[0012] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[001引 （l)miRNA種子序列通過(guò)與其祀基因的mRNA的3' UTR進(jìn)行堿基完全互補(bǔ)配對(duì)，促 進(jìn)祀基因mRNA降解或抑制mRNA翻譯。針對(duì)miRNA種子序列反義核酸可W干擾miRNA與祀 mRNA的配對(duì)。本發(fā)明提供的針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸作用于多發(fā)性骨 髓瘤細(xì)胞RPMI-8266中的miR-99a，本發(fā)明探究了微小反義寡聚核巧酸t(yī)-antimiR-99a對(duì)多 發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)，為腫瘤基因治療尋找新的方法，同時(shí)也為傳統(tǒng)的抗腫瘤機(jī)制 提供新的視角。
[0014] 似相對(duì)于成熟miRNA而言，本發(fā)明提供的針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚 核巧酸t(yī)-antimiR-99a具有分子量小，毒性小，特異性強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)，可用于腫瘤 的實(shí)驗(yàn)治療研究，有一定的藥物開(kāi)發(fā)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖 1 是 miR-99a 和 t-antimiR-99a 的序列不意圖。
[0016] 圖2是miRNA巧片分析小窠堿處理的RPMI-8266細(xì)胞miRNA族的結(jié)果分析圖，其 中，A ;巧片分析結(jié)果；B ;miR-99a~12化族成員，其中miR-99a是其中一個(gè)成員。
[0017] 圖3是miRFocus軟件分析miR-99a參與的信號(hào)通路的結(jié)果分析圖。
[001引圖4是轉(zhuǎn)染t-antimiR-99a對(duì)RPMI-8266細(xì)胞colony影響的結(jié)果分析圖，其中， A ;不同處理組顯微鏡下的集落形態(tài)巧：不同處理組的細(xì)胞克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。
[0019] 圖5是轉(zhuǎn)染t-antimiR-99a對(duì)RPMI8266細(xì)胞調(diào)亡影響的結(jié)果分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0021] 本實(shí)施例中的數(shù)據(jù)W均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD)表示，使用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件， 采用單因素方差分析法（one-way AV0NA)分析各組數(shù)據(jù)差異的顯著性。WP<〇. 05為有顯 著性差異。
[0022] 實(shí)施例1微小反義寡聚核巧酸的設(shè)計(jì)與合成
[0023] 從 miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)中(http: //www. mirbase. org/)獲取人 microRNA-99a (序 列號(hào)；M1000 OIOI)的種子序列，根據(jù)序列互補(bǔ)原理設(shè)計(jì)針對(duì)種子序列的微小反義 寡聚核巧酸序列（t-antimiR-99a)，并采用BLAST軟件分析確定其反義寡核巧酸序 列及隨機(jī)對(duì)照序列（圖1)。針對(duì)miR-99a種子序列的微小反義寡聚核巧酸序列： t-antimiR-99a(5'-TACGGGTT-3'），隨機(jī)序列（scramble, SCR) ;5' -TCATACTA-3' (8bp); 均由上海生物工程有限公司合成鎖核酸修飾，高效液相色譜（hi曲perhrmance liquid chromatography, HPLC)純化。
[0024] 實(shí)施例2細(xì)胞培養(yǎng)
[0025] 將RPMI-8266細(xì)胞（多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生化所）接 種于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，無(wú)抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37°C、體積分?jǐn)?shù) 為5%的C〇2培養(yǎng)箱，飽和濕度下培養(yǎng)。每2~3天換液傳代。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為0. 2 %的臺(tái)盼藍(lán)拒染率>95 %的細(xì)胞。
[0026] 實(shí)施例3小窠堿調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系中的miRNA族的表達(dá)
[0027] 根據(jù)之前的研究（Luo X, Gu J, Feng M,化U X, Li Y and Fei J*. Integrative analysis of differential miRNA and functional study of miR_21by seed-targeting inhibition in multiple myeloma cells in response to berberine.BMC Systems Biology2014化 1 7 ;8:82. doi : 10. 1186/1752-0509-8-82.)，本實(shí)施例選擇終濃度為 75 u M 的小窠堿炬BR)處理實(shí)施例2培養(yǎng)得到的RPMI-8266細(xì)胞4她，然后按照miRVanaTM miRNA 分離試劑盒（Ambion，Austin USA)的說(shuō)明書(shū)，分離RPMI-8266細(xì)胞的總miRNA。樣品經(jīng)過(guò) 切3