用于從流體樣品中分離細胞的系統(tǒng)、方法及部件的制作方法
【專利說明】用于從流體樣品中分離細胞的系統(tǒng)、方法及部件
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求于2012年5月29日提交的美國臨時申請N0.61/652，690和2012年5月29日提交的美國臨時申請N0.61/652，683的優(yōu)先權，其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0003]背景
1.
技術領域
[0004]本發(fā)明目前要求保護的實施方案的領域涉及用于從流體樣品中分離細胞的系統(tǒng)、方法及部件。
2.
【背景技術】
[0005]當發(fā)生實體瘤轉(zhuǎn)移時最經(jīng)常導致患者的與癌癥相關之死亡。然而癌癥轉(zhuǎn)移的分子機制在很大程度上仍不為人所知，有相當多的證據(jù)表明腫瘤細胞在惡性進展的最早期從原發(fā)性腫瘤塊脫落(Kaiser, J.Medicine.Cancer ' s circulat1n problem.Science327,1072-4 (2010) ；Bernards, R.&ffeinberg, R.A.A progress1n puzzle.Nature 418,823(2002) ；Criscitiello, C., Sotir1u, C.&Ignatiadis, M.Circulating tumor cellsand emerging blood b1markers in breast cancer.Current Opin1n in Oncology 22,552-8(2010))。這些“脫離”的癌細胞作為轉(zhuǎn)移瘤的細胞起源進入血流并輸送到身體的不同組織(Pantel,K.&BrakenhofT,R.H.Dissecting the metastatic cascade.Nature ReviewsCancer 4,448-56(2004))。從原發(fā)瘤逃脫的細胞被稱為循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumor cell, CTC) (Pantel, K.&Alix-Panabieres, C.Circulating tumour cells incancer patients:challenges and perspectives.Trends in Molecular Medicine 16,398-406(2010))。用于確定腫瘤狀態(tài)的黃金標準是通過對活組織檢查樣品進行的組織病理學分析。在早期轉(zhuǎn)移或復發(fā)中，難以鑒定活組織檢查的轉(zhuǎn)移/復發(fā)部位。
[0006]CTC可被認為是腫瘤的“液體活組織檢查”，因此提供對腫瘤細胞的方便獲取以及對潛在的致死性轉(zhuǎn)移瘤的較早獲取。然而，CTC的檢測和表征已經(jīng)因大量血液細胞(19個細胞/mL)中CTC的極低豐度(幾個至幾百個/mL)導致了技術上的挑戰(zhàn)(Racila,E.,Euhus,D., Weiss, A.J., Rao, C, McConnell, J., Terstappen, L.ff.Μ.M.&Uhr, J.ff.Detect1n andcharacterizat1n of carcinoma cells in the blood.Proceedings of the Nat1nalAcademy of Sciences of the United States of America 95,4589-4594 (1998)；Zieglschmid, V., HoIlmann, C.&Bocher, 0.Detect1n of disseminated tumor cellsin peripheral blood.Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 42,155-96 (2005))。已經(jīng)證實發(fā)現(xiàn)CTC的數(shù)量隨治療期過程的變化是實體瘤患者的治療結(jié)果、無進展存活和總體存活的獨立預測因子(Cristofanilli，M.，Budd, G.T.，Ellis,M.J., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M.C., Reuben, J.M., Doyle, G.V., Allard, ff.J.,Terstappen, L.ff.&Hayes, D.F.Circulating tumor cells, disease progress1n, andsurvival in metastatic breast cancer.The New England journal of medicine 351，781-91 (2004))。此外，對見于癌癥患者中的這些CTC進行分子分析可獲得可指導癌癥患者之有效治療的關鍵基因組、蛋白質(zhì)組或代謝物組信息。
[0007]雖然許多技術可用于固定CTC，但是它們卻不能從非特異性捕獲的白細胞(WBC)背景分離單個CTC以用于后續(xù)分子和功能分析(例如，全基因組測序，RT-PCR)。因此，依然需要改進的裝置和方法來從全血和/或其他體液分離稀有細胞，例如CTC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]根據(jù)本發(fā)明之一個實施方案的用于從包含多種細胞類型的流體樣品中分離預選細胞類型的系統(tǒng)，其包含細胞捕獲流體芯片和芯片保持器(chip holder)，所述保持器配置成用于容納所述細胞捕獲流體芯片并且維持所述細胞捕獲流體芯片在運行中基本上流體緊密密封。所述芯片保持器還被配置成釋放待從芯片保持器中移出的細胞捕獲流體芯片以用于進一步處理。細胞捕獲流體芯片包含基底、設置在所述基底上的激光顯微切割膜和設置在所述激光顯微切割膜(laser micro-dissect1n membrane)上的通道限定層。所述激光顯微切割膜具有相對于多種細胞類型中的其他細胞類型適于優(yōu)先捕獲預選細胞類型的表面。所述通道限定層可從激光顯微切割膜移除來進行細胞捕獲流體芯片的進一步處理。所述細胞捕獲流體芯片具有適于與流體源相連接的輸入端口和用于排出經(jīng)處理流體的輸出端口，以使得在運行中流體樣品從流體源流出并通過由激光顯微切割膜的至少一部分表面之上的通道限定層所限定的流體通道。根據(jù)本發(fā)明之一個實施方案的用于在運行中維持細胞捕獲流體芯片基本上流體緊密密封的芯片保持器，其包含限定凹陷區(qū)的基礎部件以使所述細胞捕獲流體芯片容納其中；壓力部件，其被配置成放置于細胞捕獲流體芯片之上；以及夾具組件(clamp assembly),其被配置成用于將所述基礎部件和所述壓力部件夾在一起從而在操作期間維持基本上流體緊密密封。所述夾具組件被進一步配置成松開以釋放細胞捕獲流體芯片從而從芯片保持器中移出。
[0009]根據(jù)本發(fā)明之一個實施方案的用于從包含多種細胞類型的流體樣品中捕獲預選細胞類型的細胞捕獲流體芯片，其包含基底、設置在所述基底上的激光顯微切割膜和設置在所述激光顯微切割膜上的通道限定層。所述激光顯微切割膜具有相對于多種細胞類型中的其他細胞類型適于優(yōu)先捕獲預選細胞類型的表面。所述通道限定層能從激光顯微切割膜上移除以用于進一步處理細胞捕獲流體芯片，并且所述細胞捕獲流體芯片具有適于與流體源相連接的輸入端口和用于排出經(jīng)處理流體的輸出端口，以使得在運行中流體樣品從流體源流出并通過由激光顯微切割膜的至少一部分表面之上的通道限定層所限定的流體通道。
[0010]根據(jù)本發(fā)明之一個實施方案的用于從包含多種細胞類型的流體樣品分離預選細胞類型的方法，包括提供細胞捕獲流體芯片，所述細胞捕獲流體芯片包含基底、設置在所述基底上的激光顯微切割膜和設置在所述激光顯微切割膜上的通道限定層。所述激光顯微切割膜具有相對于多種細胞類型中的其他細胞類型適于優(yōu)先捕獲預選細胞類型的表面。所述方法還包括提供流體樣品，使得其流動通過由激光顯微切割膜的至少部分表面之上的通道限定層所限定的流體通道以從流體樣品中捕獲預選細胞類型，在提供流體樣品后，從細胞捕獲流體芯片的基底和激光顯微切割膜上移除通道限定層，以及在移除通道限定層后，在細胞捕獲流體芯片的基底和激光顯微切割膜上進行激光顯微切割以從流體樣品中收集捕獲的預選細胞類型。
【附圖說明】
[0011 ] 在考慮說明書、附圖和實施例的情況下，其他目的和優(yōu)點將變得明顯。
[0012]圖1示出根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案用于從具有多種細胞類型的流體樣品分離預選細胞類型的系統(tǒng)。
[0013]圖2A、圖2B和圖2C分別示出圖1系統(tǒng)的透視圖、正視圖和俯視圖。
[0014]圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的細胞捕獲流體芯片的示意圖。
[0015]圖4A是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的芯片保持器的圖示。
[0016]圖4B是圖4A的芯片保持器的另一個圖示，但處于準備好加載細胞捕獲流體芯片的配置。
[0017]圖5A至圖5C示出芯片保持器的一些替代實施方案。
[0018]圖6A至圖6G輔助說明了本發(fā)明一個實施方案的一個實施例。a)流過Nano VelcroCTC芯片的血液樣品。b)所述裝置包含覆蓋微流體混沌混合器和透明Nano Velcro基底(通過將靜電紡絲PLGA納米纖維沉積在LMD載玻片上制得)。c) SEM圖像示出水平壓縮的超長PLGA納米纖維的形態(tài)(直徑為約10nm)。d)可將具有固定的CTC的透明Nano Velcro基底與激光顯微切割或激光捕獲激光顯微切割儀器相連接用于單個細胞分離。e)具有從采集自轉(zhuǎn)移性癌癥患者的ImL血液分離的45個CTC的Nano Velcro CTC芯片。f)固定在透明Nano Velcro基底上的CTC。g)通過使用LMD技術，在分割的基底上分離單個CTC(插圖)。
[0019]圖7為概述以下的示意圖:a)用于在嵌入透明Nano Velcro基底中的PLGA納米纖維上引入鏈親和素涂層的共價綴合方法；以及b)用于將抗生物污損的PEG基團引入在NanoVelcro基底上的替代表面改性方法，從而抑制WBC的非特異性捕獲并且增強Nano Velcro基底的穩(wěn)定性以用于長期儲存和便利運輸。
[0020]圖8A示出根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案從患黑素瘤患者的血液樣品捕獲并分離單個CTC和WBC。在PCR擴增后，檢測到內(nèi)含子中BRAFvkicie突變和NRAS缺失(NRAS外顯子2的3'端37bp ;核苷酸CCCT缺失)。此處采用WBC作為對照樣品(野生型)。
[0021]圖8B示出使