例中，該單鏈寡核苷酸包括所有核苷酸之間的修飾的核苷酸間鍵（例如，硫代磷酸 酯核苷酸間鍵或其他鍵）。
[0030] 在一些實(shí)施例中，該寡核苷酸的3'位置處的核苷酸具有3'輕基。在一些實(shí)施例 中，該寡核苷酸的3'位置處的核苷酸具有3'硫代磷酸酯。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷 酸具有生物素部分或綴合至其5'或3'核苷酸的其他部分。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核 苷酸具有膽固醇、維生素 A、葉酸、σ受體配體、適體、肽、如CPP、疏水性分子如脂質(zhì)、ASGPR 或動(dòng)態(tài)多聚綴合物以及其在5'或3'端處的變體。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供包含在此披露的任何寡核苷酸以及載體的組合物。 在一些實(shí)施例中，提供在緩沖溶液中包含任何寡核苷酸的組合物。在一些實(shí)施例中，將寡核 苷酸綴合至載體。在一些實(shí)施例中，載體為肽。在一些實(shí)施例中，載體為類固醇。根據(jù)本 發(fā)明的一些方面，提供包含在此披露的任何寡核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合 物。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供包括容納在此披露的任何組合物的容器的試劑盒。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供提高細(xì)胞內(nèi)MECP2的表達(dá)的方法。在一些實(shí)施例中， 這些方法包括將在此披露的單鏈寡核苷酸中的任一種或多種遞送至細(xì)胞。在一些實(shí)施例 中，將該單鏈寡核苷酸遞送至細(xì)胞導(dǎo)致MECP2的表達(dá)水平大于（例如，至少50 %大于）不包 括該單鏈寡核苷酸的對(duì)照細(xì)胞中的MECP2的表達(dá)水平。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，提供提高受試者體內(nèi)MECP2的水平的方法。根據(jù)本發(fā) 明的一些方面，提供治療受試者體內(nèi)與降低的MECP2水平相關(guān)的病癥（例如瑞特綜合征、 MECP2相關(guān)的嚴(yán)重新生兒腦病、安格爾曼綜合征、PPM-X綜合征）的方法。在一些實(shí)施例中， 這些方法包括向該受試者給予在此披露的單鏈寡核苷酸中的任一種或多種。
[0035] 表格簡(jiǎn)沭
[0036] 表1 :非為人miRNA的種子序列的六聚物 [0037] 表2:寡核苷酸修飾列表
[0038] 表3 :為顯示核苷酸修飾的測(cè)試制備的格式化寡核苷酸序列。表格示出修飾的核 苷酸序列，其中InaX表示具有3'硫代磷酸酯鍵的LNA核苷酸，omeX為2' -0-甲基核苷酸， dX為脫氧核苷酸。核苷酸碼末端處的s指示該核苷酸具有3'硫代磷酸酯鍵。序列末端處 的"-Sup"標(biāo)記以下事實(shí)：3'末端的3'鍵上缺少磷酸酯或硫代磷酸酯。格式化序列列示出 了包括修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0039] 本發(fā)明的某@實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明
[0040] 在此提供的本發(fā)明的方面涉及發(fā)現(xiàn)多梳阻抑復(fù)合物2(PRC2)_相互作用RNA。多 梳阻抑復(fù)合物2(PRC2)為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶以及使基因組區(qū)通過(guò)組蛋白H3的甲基化沉默 中涉及的已知的表觀遺傳調(diào)控劑（epigenetic regulator)。在其他功能中，PRC2與長(zhǎng)的非 編碼RNA (IncRNA)如R印A、Xist以及Tsix相互作用以便催化組蛋白H3-賴氨酸27的三甲 基化。PRC2含有四個(gè)亞單位 ：Eed、SuZ12、RbAp48以及EZh2。本發(fā)明的方面涉及單鏈寡核 苷酸可以誘導(dǎo)或增強(qiáng)MECP2的表達(dá)的認(rèn)識(shí)，這些單鏈寡核苷酸結(jié)合至在基因組區(qū)內(nèi)表達(dá)的 RNA(例如，IncRNA)的PRC2相關(guān)區(qū)，該基因組區(qū)涵蓋或功能性接近MECP2基因。在一些實(shí) 施例中，認(rèn)為這個(gè)上調(diào)源于PRC2介導(dǎo)的MECP2的阻抑的抑制作用。
[0041] 如在此所使用，術(shù)語(yǔ)"PRC2相關(guān)區(qū)"是指包括或編碼與PRC2的組分直接或間接相 互作用的核苷酸序列的核酸的區(qū)域。PRC2相關(guān)區(qū)可以存在于與PRC2相互作用的RNA(例 如，長(zhǎng)的非編碼RNA(IncRNA))中。PRC2相關(guān)區(qū)可以存在于編碼與PRC2相互作用的RNA的 DNA中。在一些情況下，該P(yáng)RC2相關(guān)區(qū)等效地稱為PRC2相互作用區(qū)。
[0042] 在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)為響應(yīng)于對(duì)表達(dá)RNA的細(xì)胞的原位紫外線輻射而交 聯(lián)至PRC2的組分的RNA的區(qū)域，或編碼所述RNA區(qū)域的基因組DNA的區(qū)域。在一些實(shí)施例 中，PRC2相關(guān)區(qū)為與靶向PRC2的組分的抗體一起免疫沉淀的RNA的區(qū)域，或編碼所述RNA 區(qū)域的基因組DNA的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)為與特異性結(jié)合至SUZ12、EED、 EZH2或RBBP4 (如上所述為PRC2的組分）的抗體一起免疫沉淀的RNA的區(qū)域，或編碼所述 RNA區(qū)域的基因組DNA的區(qū)域。
[0043] 在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)為在采用靶向PRC2的組分的抗體的RNA免疫沉淀 測(cè)定中被保護(hù)免于核酸酶（例如，RNase)破壞的RNA的區(qū)域，或編碼所述受保護(hù)的RNA區(qū) 域的基因組DNA的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)為在采用靶向SUZ12、EED、EZH2或 RBBP4的抗體的RNA免疫沉淀測(cè)定中被保護(hù)免于核酸酶（例如，RNase)破壞的RNA的區(qū)域， 或編碼所述受保護(hù)的RNA區(qū)域的基因組DNA的區(qū)域。
[0044] 在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)為RNA的區(qū)域，其中在采用靶向PRC2的組分的抗體 的RNA免疫沉淀測(cè)定的產(chǎn)物的測(cè)序反應(yīng)中出現(xiàn)相對(duì)高頻率的序列讀取，或編碼所述RNA區(qū) 域的基因組DNA的區(qū)域。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)為RNA的區(qū)域，其中在采用特異性 結(jié)合至SUZ12、EED、EZH2或RBBP4的抗體的RNA免疫沉淀測(cè)定的產(chǎn)物的測(cè)序反應(yīng)中出現(xiàn)相 對(duì)高頻率的序列讀取，或編碼所述受保護(hù)的RNA區(qū)域的基因組DNA的區(qū)域。在這類實(shí)施例 中，該P(yáng)RC2相關(guān)區(qū)可以稱為"峰"。
[0045] 在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)包括與PRC2復(fù)合物相互作用的、具有40至60個(gè)核 苷酸的序列。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)包括編碼與PRC2相互作用的RNA的、具有40至 60個(gè)核苷酸的序列。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)包括長(zhǎng)度高達(dá)5kb、包括與PRC2相互作 用的序列（例如，具有40至60個(gè)核苷酸）的序列。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)包括長(zhǎng)度 高達(dá)5kb的序列，其中編碼具有已知與PRC2相互作用的序列（例如，具有40至60個(gè)核苷 酸）的RNA。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)包括長(zhǎng)度約4kb、包括與PRC2相互作用的序列 (例如，具有40至60個(gè)核苷酸）的序列。在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)包括長(zhǎng)度約4kb的 序列，其中編碼包括已知與PRC2相互作用的序列（例如，具有40至60個(gè)核苷酸）的RNA。 在一些實(shí)施例中，PRC2相關(guān)區(qū)具有如SEQ ID NO :5至118中任一個(gè)中給出的序列。
[0046] 在一些實(shí)施例中，提供單鏈寡核苷酸，其特異性結(jié)合至涵蓋或接近MECP2基因的 基因組區(qū)內(nèi)的PRC2相關(guān)區(qū)或與其互補(bǔ)。在一些實(shí)施例中，提供單鏈寡核苷酸，其特異性結(jié) 合至具有如SEQ ID NO :5至118中任一個(gè)中給出的序列的PRC2相關(guān)區(qū)或與其互補(bǔ)。在一 些實(shí)施例中，提供單鏈寡核苷酸，其特異性結(jié)合至PRC2相關(guān)區(qū)或與其互補(bǔ)，該P(yáng)RC2相關(guān)區(qū) 具有如SEQ ID NO :5至118中任一個(gè)中給出的序列，該序列連同來(lái)自這些SEQ ID所定位的 相應(yīng)基因組區(qū)（例如，在人基因組中）的2kb、高達(dá)5kb或高達(dá)IOkb側(cè)接序列相結(jié)合。在一 些實(shí)施例中，單鏈寡核苷酸具有如SEQ ID NO :119至83660中任一個(gè)中給出的序列。在一 些實(shí)施例中，單鏈寡核苷酸具有如表3中給出的序列。
[0047] 無(wú)意受限于本發(fā)明的理論，這些寡核苷酸能夠通過(guò)防止將PRC2募集至特定染色 體基因座來(lái)干擾PRC2的結(jié)合和功能。例如，設(shè)計(jì)成特異性結(jié)合PRC2相關(guān)區(qū)IncRNA的單 鏈寡核苷酸的單一給藥通過(guò)結(jié)合染色質(zhì)不僅可以穩(wěn)定地替換IncRNA，而且可以替換結(jié)合至 IncRNA的PRC2。在替換之后，PRC2的完整補(bǔ)體在高達(dá)24小時(shí)之內(nèi)未恢復(fù)。另外，IncRNA 能夠以順式方式募集PRC2,從而阻抑轉(zhuǎn)錄IncRNA的特定染色體基因座處或附近的基因表 達(dá)。
[0048] 在一些實(shí)施例中，提供調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，這些方法可以在體外、離體或體內(nèi)執(zhí) 行。應(yīng)理解，整個(gè)說(shuō)明書中對(duì)化合物的用途的任何提及涵蓋所述化合物在制備用于治療與 MECP2的降低的水平或活性相關(guān)聯(lián)的病癥（例如，瑞特綜合征、MECP2相關(guān)的嚴(yán)重新生兒腦 病、安格爾曼綜合征、PPM-X綜合征）的藥物組合物或藥劑中的用途。因此，作為一個(gè)非限制 性實(shí)例，本發(fā)明的這個(gè)方面包括這類單鏈寡核苷酸在制備用于治療疾病的藥劑中的用途， 其中該治療包括上調(diào)MECP2的表達(dá)。
[0049] 在本發(fā)明的另外的方面，提供用于選擇用于激活MECP2的表達(dá)的候選寡核苷酸的 方法。這些方法通常包括選擇包括與PRC2相關(guān)區(qū)互補(bǔ)的核苷酸序列（例如，如SEQ ID NO: 5至118中任一個(gè)中給出的核苷酸序列）的單鏈寡核苷酸作為候選寡核苷酸。在一些實(shí)施 例中，可以選擇富集了激活MECP2的表達(dá)的寡核苷酸（例如，與隨機(jī)寡核苷酸選擇相比較） 的多組寡核苷酸。
[0050] 用于調(diào)節(jié)MECP2的表達(dá)的單鏈寡核苷酸
[0051] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供用于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)MECP2的表達(dá)的、與PRC2相關(guān)區(qū)互補(bǔ) 的單鏈寡核苷酸。在一些實(shí)施例中，上調(diào)或提高M(jìn)ECP2的表達(dá)。在一些實(shí)施例中，與這些 PRC2相關(guān)區(qū)互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸抑制PRC2與長(zhǎng)的RNA轉(zhuǎn)錄物的相互作用，以使得上調(diào)或 提高基因表達(dá)。在一些實(shí)施例中，與這些PRC2相關(guān)區(qū)互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸抑制PRC2與長(zhǎng) 的RNA轉(zhuǎn)錄物的相互作用，從而導(dǎo)致組蛋白H3的減少的甲基化以及減少的基因失活，這樣 使得上調(diào)或提高基因表達(dá)。在一些實(shí)施例中，這種相互作用可能因防止或減少結(jié)合至PRC2 的長(zhǎng)的RNA的結(jié)構(gòu)的變化而被破壞或抑制?？梢允褂迷诖伺队糜谶x擇用于激活MECP2的 表達(dá)的候選寡核苷酸的任何方法來(lái)選擇寡核苷酸。
[0052] 該單鏈寡核苷酸可以包括與SEQ ID NO :1至4中任一個(gè)中給出的核苷酸序列的 PRC2相關(guān)區(qū)互補(bǔ)的一個(gè)互補(bǔ)區(qū)。該單鏈寡核苷酸的互補(bǔ)區(qū)可以與PRC2相關(guān)區(qū)的至少6、例 如至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或更多個(gè)連續(xù)核苷酸互補(bǔ)。
[0053] PRC2相關(guān)區(qū)可以定位至染色體中在MECP2基因的5'端上游50千堿基與MECP2基 因的3'端下游50千堿基之間的位置。PRC2相關(guān)區(qū)可以定位至染色體中在MECP2基因的 5'端上游25千堿基與MECP2基因的3'端下游25千堿基之間的位置。PRC2相關(guān)區(qū)可以定 位至染色體中在MECP2基因的5'端上游12千堿基與MECP2基因的3'端下游12千堿基之 間的位置。PRC2相關(guān)區(qū)可以定位至染色體中在MECP2基因的5'端上游5千堿基與MECP2 基因的3'端下游5千堿基之間的位置。
[0054] 所選擇的PRC2相關(guān)區(qū)相對(duì)于MECP2基因的基因組位置可以變化。例如，PRC2相關(guān) 區(qū)可以位于MECP2基因的5'端上游。PRC2相關(guān)區(qū)可以位于MECP2基因的3'端下游。PRC2 相關(guān)區(qū)可以位于MECP2基因的內(nèi)含子內(nèi)。PRC2相關(guān)區(qū)可以位于MECP2基因的外顯子內(nèi)。PRC2 相關(guān)區(qū)可以橫跨MECP2基因的內(nèi)含子-外顯子接點(diǎn)、5' -UTR-外顯子接點(diǎn)或3' -UTR-外顯 子接點(diǎn)。
[0055] 該單鏈寡核苷酸可以包括具有式X-Y-Z的序列，其中X為任何核苷酸，Y為非為微 小RNA的人種子序列的、長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸的核苷酸序列，并且Z為具有變化的長(zhǎng)度的核苷 酸序列。在一些實(shí)施例中，X為寡核苷酸的5'核苷酸。在一些實(shí)施例中，當(dāng)X錨定在寡核 苷酸的5'端時(shí)，寡核苷酸不具有在5'連接至X的任何核苷酸或核苷酸類似物。在一些實(shí) 施例中，其他化合物如肽類或固醇類在這個(gè)實(shí)施例中可以連接在5'端上，只要它們不為核 苷酸或核苷酸類似物即可。在一些實(shí)施例中，該單鏈寡核苷酸具有序列5' X-Y-Z并且長(zhǎng)度 為8至50個(gè)核苷酸。預(yù)測(cè)具有這些序列特征的寡核苷酸以便避免miRNA路徑。因此，在一 些實(shí)施例中，具有這些序列特征的寡核苷酸不可能具有在細(xì)胞內(nèi)起到miRNA分子作用的不 期望的結(jié)果。Y序列可以為表1中給出的長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
[0056] 該單鏈寡核苷酸可以具有不含有尿苷核苷酸伸展段（例如，3個(gè)或更多個(gè)、4個(gè)或 更多個(gè)、5個(gè)或更多個(gè)、6個(gè)或更多個(gè)連續(xù)鳥(niǎo)苷核苷酸）的序列。在一些實(shí)施例中，與不具有 鳥(niǎo)苷核苷酸伸展段的寡核苷酸相比較，具有鳥(niǎo)苷核苷酸伸展段的寡核苷酸具有提高的非特 異性結(jié)合和/或脫靶效應(yīng)。
[0057] 該單鏈寡核苷酸可以具有與具有相等長(zhǎng)度的每個(gè)核苷酸序列具有小于閾值水平 的序列一致性的序列，這些核苷酸定位至涵蓋或接近脫靶基因的基因組位置。例如，寡核苷 酸可以被設(shè)計(jì)來(lái)確保其不具有定位至涵蓋或接近除MECP2之外的所有已知基因（例如，所 有已知蛋白編碼基因）的基因組位置的序列。在類似的實(shí)施例中，寡核苷酸可以被設(shè)計(jì)來(lái) 確保其不具有定位至任何其他已知的PRC