一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二 醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1，3-丙二醇（1，3-propanediol，1，3-PD0)，分子式為 HOCH2-CH2-CH2Oh,是眾多聚 合物的基礎(chǔ)原料，目前為國際上公認(rèn)的石化新產(chǎn)品之一，可用于化妝品、液體清潔劑、防凍 液、服裝、室內(nèi)裝飾材料、工程聚合物等諸多領(lǐng)域。
[0003] 1，3-丙二醇的合成方法分為兩大類：化學(xué)法和微生物發(fā)酵法。其中化學(xué)法包括丙 烯醛水合加氫法和環(huán)氧乙烷羰基化法，丙烯醛水合加氫法的產(chǎn)品成本略高，而環(huán)氧乙烷羰 基化法的設(shè)備投資大、技術(shù)難度高，微生物發(fā)酵法因其具有條件溫和、原料價廉易得、成本 低等特點，是一種具有廣闊發(fā)展前景的1，3-丙二醇生產(chǎn)路線。
[0004] 微生物發(fā)酵法是指以甘油或葡萄糖為底物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的生產(chǎn)工 藝。從自然界中篩選出來的能以甘油為碳源、利用自身代謝途徑生產(chǎn)1，3-丙二醇的野生型 菌株主要集中在腸桿菌科、梭菌屬和乳桿菌屬，目前研究較多的三種菌為克雷伯氏肺炎桿 菌弗氏朽1 樣菌（CYiroAacier 以及丁酸梭狀芽抱桿 魯{Clostridia butyricum)。
[0005] 甘油在微生物體內(nèi)有三條代謝途徑。其中之一為消耗能量、產(chǎn)生還原力的菌體生 成途徑；另外兩個途徑為氧化途徑和還原途徑。
[0006] 氧化途徑主要步驟為：（1)甘油在甘油脫氫酶（⑶H)催化下，生成二羥丙酮（DHA)， 同時生成還原性輔酶I (NADH2)15 (2)二羥丙酮（DHA)在二羥丙酮激酶（DhaK)作用下，生成 磷酸二羥丙酮（DHAP)。此步反應(yīng)需要消耗能量三磷酸腺苷（ATP)。（3)磷酸二羥丙酮（DHAP) 進(jìn)入糖酵解途徑生成丙酮酸。然后，丙酮酸代謝生成乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)再生成其 他小分子物質(zhì)。
[0007] 還原途徑主要步驟為：（1)甘油在甘油脫水酶（⑶Ht)作用下生成3-羥基丙醛 (3-HPA)，此甘油脫水酶（⑶Ht)需要以維生素 B12為輔酶。（2)3_羥基丙醛（3-HPA)在1，3-丙 二醇氧化還原酶（PDOR)作用下生成1，3-丙二醇。此過程需要消耗還原性輔酶I (NADH2)15
[0008] 1，3-丙二醇生產(chǎn)菌株代謝甘油后，發(fā)酵液中除1，3-丙二醇外，還會有其他代謝副 產(chǎn)物，如乙酸、乙醇、2, 3-丁二醇、乳酸等，這些副產(chǎn)物不但會對發(fā)酵菌體的生長代謝產(chǎn)生影 響，還會在后期的產(chǎn)物分離純化過程中帶來諸多問題。因此，減少發(fā)酵體系過程中副產(chǎn)物的 含量，將有助于提高微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的產(chǎn)率。
[0009] CN1696298A公開了一種外源添加反丁烯二酸促進(jìn)微生物合成1，3_丙二醇的方 法，該方法通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加反丁烯二酸作為外源電子受體，來加速菌體對甘油的 利用，但通過其實施例可以看到該方法發(fā)酵液中的副產(chǎn)物含量也明顯增多。CN1446919A公 開了外源添加還原劑促進(jìn)菌體合成1，3-丙二醇的方法，其通過在發(fā)酵培養(yǎng)基或在厭氧發(fā) 酵過程中添加適量的還原劑，增強(qiáng)菌體中還原當(dāng)量的積累，促進(jìn)底物甘油沿還原途徑代謝 來提高1，3-丙二醇的合成濃度和轉(zhuǎn)化率，但大量外源還原劑的加入無助于菌體生物量的 增加，并且會促進(jìn)副反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致大量副產(chǎn)物的生成。CN101230362A公開了一種改變細(xì)胞 膜通透性有效生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，該方法通過添加非離子表面活性劑改變細(xì)胞膜通 透性，減少氧及營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的傳遞阻力，并促使代謝產(chǎn)物分泌至胞外，降低代謝產(chǎn)物 在細(xì)胞內(nèi)的積累，提高發(fā)酵終產(chǎn)物1，3-丙二醇的濃度，但是非離子表面活性劑對菌體具有 一定的毒害作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法， 該方法可以強(qiáng)化菌體消耗能量、產(chǎn)生還原力的菌體生成途徑，有效的促進(jìn)菌體生長，并增強(qiáng) 菌體細(xì)胞膜的通透性，提高菌體對甘油的利用率。
[0011] 本發(fā)明的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3_丙二醇的方法，包括如下內(nèi)容：菌種經(jīng)種子活 化、種子培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，種子培養(yǎng)液在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以甘油為發(fā)酵底物，進(jìn)行厭氧 或微氧發(fā)酵，發(fā)酵期間通過補(bǔ)料方式維持發(fā)酵底物濃度，發(fā)酵結(jié)束后，分離回收1，3-丙二 醇產(chǎn)品；其中在配制發(fā)酵培養(yǎng)基過程和/或發(fā)酵過程中加入鈣類助劑；優(yōu)選在配制發(fā)酵培 養(yǎng)基過程和發(fā)酵過程分別加入一定質(zhì)量的鈣類助劑；所述的鈣類助劑，選自果糖酸鈣、半乳 糖酸鈣、葡萄糖酸鈣、蔗糖酸鈣或乳糖酸鈣中的一種或幾種。
[0012] 本發(fā)明方法中，發(fā)酵體系中鈣類助劑的濃度為l~l〇〇g/L。
[0013] 本發(fā)明方法中，所述菌種為克雷伯氏肺炎桿菌弗氏朽1 樣菌(CYiroAacier 或丁酸梭狀芽抱桿菌（67(osirit/ia Zwijrictt?)。
[0014] 本發(fā)明方法中，菌種活化、菌種培養(yǎng)和發(fā)酵過程均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，其中 將每一階段的培養(yǎng)液按照規(guī)定的接種量逐級接種至下一階段。
[0015] 本發(fā)明方法中，菌種活化、菌種培養(yǎng)和發(fā)酵過程各階段的培養(yǎng)溫度均為30? 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速為200?500rpm ;其中菌種活化階段培養(yǎng)時間為8?12小時，種子培養(yǎng)時 間為8?12小時。
[0016] 本發(fā)明方法中，所述的厭氧發(fā)酵條件為：氮氣通入量為2?4vvm，微氧發(fā)酵條件 為：空氣通入量為0. 25?0. 5vvm，優(yōu)選微氧發(fā)酵；發(fā)酵體系的pH控制在6?8之間，發(fā)酵 培養(yǎng)時間36?72h。
[0017] 本發(fā)明方法中，通過補(bǔ)料方式維持發(fā)酵液中的甘油濃度在10?80g/L，優(yōu)選為分 批補(bǔ)料發(fā)酵方式。
[0018] 本發(fā)明方法中，發(fā)酵過程中優(yōu)選使用流加甘油作為補(bǔ)料方式，其中所述的流加甘 油是體積濃度為70%?90%的甘油水溶液。
[0019] 本發(fā)明方法中，鈣類助劑優(yōu)選在發(fā)酵過程中與流加甘油混合引入。
[0020] 本發(fā)明方法中，所述的種子活化培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基)各組分含量如下：蛋白胨7? 15g/L，酵母膏 3 ?10g/L，NaCl 7 ?15g/L。
[0021] 本發(fā)明方法中，所述的種子培養(yǎng)基各組分含量如下：酵母膏7?15g/L，麥芽糖 1 ?5g/L，蛋白腺 3 ?10g/L，NaCl 3 ?10g/L。
[0022] 本發(fā)明方法中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基各組分含量如下：酵母膏3?10g/L， K2HPO4 · 3H20 3 ?10g/L，KH2PO4 1 ?5g/L，NH4Cl 1 ?5g/L，NaCl 0· 1 ?2g/L，MgSO4 · 7H20 0· 1 ?2g/L，F(xiàn)eCl3 · 6H20 5 ?100mg/L，CoCl2 · 6H20 5 ?100mg/L，維生素 B12 5 ?IOOmg/ L，甘油 10 ?80g/L。
[0023] 本發(fā)明方法中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基體積比為I :10?1 :50。
[0024] 本發(fā)明方法中，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有C、P、K、Na、Mg等微生物生長所必需的營養(yǎng)物 質(zhì)，也可根據(jù)需要補(bǔ)充微生物營養(yǎng)物質(zhì)。
[0025] 本發(fā)明的有益效果在于： 1、本發(fā)明方法中鈣類助劑的引入，能夠強(qiáng)化菌體消耗能量、產(chǎn)生還原力的菌體生成途 徑，有效的促進(jìn)菌體生長，使生物催化活性單位大量增加，同時產(chǎn)生的還原當(dāng)量還可為菌體 甘油代謝的還原途徑提供必需的還原力。
[0026] 2、鈣類助劑中所含的鈣離子還可作用于菌體細(xì)胞膜，通過增強(qiáng)菌體細(xì)胞膜的通透 性，來降低菌體對甘油和1，3_丙二醇的選擇性透過作用，以此來增強(qiáng)菌體對甘油的利用 率，使菌種保持在較高的發(fā)酵水