一種來源于虎眼萬年青的肉桂酸-4-羥化酶，其核苷酸序列及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種肉桂酸-4-羥化酶，其編碼基因及其在催化底物肉桂酸為對香豆 酸中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。特別涉及虎眼萬年青肉桂酸-4-羥化酶，其編碼基因及其 在催化底物反式肉桂酸形成產(chǎn)物對香豆酸反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 肉桂酸 _4_ 輕化酶（Cinnamate4-hydroxylase, C4H，ECL 14. 13. 11)，又稱反式肉 桂酸-4-單氧化酶，是細(xì)胞色素 P450家族成員。作為黃酮類天然產(chǎn)物生物合成途徑中的 一個關(guān)鍵酶，C4H可以高效地催化反式肉桂酸生成對香豆酸，進(jìn)而形成黃酮類化合物。因 此，克隆肉桂酸-4-羥化酶基因并對其進(jìn)行功能鑒定可以為黃酮類化合物的合成生物學(xué)研 究提供必要的基因元器件。目前我國僅從羽衣甘藍(lán)、亞洲棉，苦蕎，膜夾黃芪，甘藍(lán)型油菜， 大豆，丹參和花生等植物分離出C4H基因，且停留在基因分析克隆及轉(zhuǎn)化的水平，并沒有 更深入的研究報道。國外的研究包括從韓國黑樹莓（Korean black raspberry),長春花 (Catharanthus roseus)和花葉地錦（Parthenocissus henryana)等植物中分離 C4H 的報 道，未見有從虎眼萬年青（Ornithogalum saundersiae)分離C4H基因并進(jìn)行功能鑒定方面 的相關(guān)報道。本發(fā)明通過對虎眼萬年青進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了虎眼萬年青肉桂酸-4-羥 化酶序列信息。通過提取虎眼萬年青RNA，利用RT-PCR，從虎眼萬年青無菌鱗莖中克隆得到 一個肉桂酸4-羥化酶基因，命名為0saC4H，并對其進(jìn)行了功能鑒定，這是首次從虎眼萬年 青植物中克隆得到這個基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的首要目的是提供一種肉桂酸-4-羥化酶。
[0005] 本發(fā)明的第二目的是提供編碼該酶的核苷酸序列。
[0006] 本發(fā)明的第三目的是提供含有該核苷酸序列的表達(dá)載體。
[0007] 本發(fā)明的第四目的是提供含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的第五目的是提供肉桂酸-4-羥化酶的應(yīng)用。
[0009] 為了實現(xiàn)本發(fā)明之目的，采用的技術(shù)方案為：
[0010] 本發(fā)明提供一種來源于虎眼萬年青的肉桂酸-4-羥化酶，其特征在于：
[0011] a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0012] b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列經(jīng)替換，缺失或添加1-60個氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種編碼所述肉桂酸-4-羥化酶的基因序列，其核 苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 本發(fā)明還提供一種含有所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
[0014] 本發(fā)明還提供一種所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。其中所選宿主細(xì)胞優(yōu)選釀酒酵母， 大腸桿菌，畢赤酵母，鏈霉菌和植物細(xì)胞，更優(yōu)選的宿主細(xì)胞選自釀酒酵母。
[0015] 本發(fā)明還提供了肉桂酸-4-羥化酶或含有肉桂酸-4-羥化酶的細(xì)胞在催化底物反 式肉桂酸形成產(chǎn)物對香豆酸反應(yīng)中的應(yīng)用。其中肉桂酸-4-羥化酶的底物包括反式肉桂 酸，形成的產(chǎn)物為對香豆酸。
【附圖說明】
[0016] 圖I :0saC4H和其他物種的C4H的比對結(jié)果。
[0017] 圖2 :0saC4H結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果。
[0018] 圖3 :0saC4H三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。
[0019] 圖4 :0saC4H基因擴(kuò)增結(jié)果，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1是0saC4H基因 PCR結(jié)果。
[0020] 圖5 :重組質(zhì)粒pYeDP60_0saC4H示意圖。
[0021] 圖6 :WHT[pYeDP60-0saC4H]菌落PCR結(jié)果，其中M是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-5是5個 WHT[pYeDP60-0saC4H]克隆的菌落 PCR 結(jié)果。
[0022] 圖7 :酶促反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC色譜結(jié)果。其中1是反式肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析 結(jié)果；2是WHT[pYeDP60]酶促反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果；3是WHT[pYeDP60-0saC4H]酶促 反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果；4是對香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析結(jié)果。
[0023] 圖8 :酶促反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC-UV色譜結(jié)果。
[0024] 圖9 :酶促反應(yīng)產(chǎn)物的總離子色譜圖。
[0025] 圖10 :m/zl63的[Μ-ΗΓ離子的提取離子色譜圖。
[0026] 圖11 :保留時間9. 95min的[Μ-ΗΓ離子的MS譜圖。
[0027] 圖12 :m/zl47的[Μ-ΗΓ離子的提取離子色譜圖。
[0028] 圖13 :保留時間14. 44min的[Μ-ΗΓ離子的MS譜圖。
[0029] 圖14 :標(biāo)準(zhǔn)品對香豆酸的HPLC-UV譜圖。
[0030] 圖15 :標(biāo)準(zhǔn)品對香豆酸的全離子掃描結(jié)果。
[0031] 圖16 :標(biāo)準(zhǔn)品對香豆酸（[Μ-ΗΓ離子，m/zl63)的提取離子色譜圖。
[0032] 圖17 :標(biāo)準(zhǔn)品對香豆酸（[M-H]_離子，m/zl63)的MS譜圖。
[0033] 圖18 :0saC4H催化反式肉桂酸形成的產(chǎn)物的1H NMR結(jié)果。
[0034] 圖19 :0saC4H催化反式肉桂酸形成的產(chǎn)物的13C NMR結(jié)果。
[0035] 圖20 :0saC4H催化反式肉桂酸形成的產(chǎn)物的HMQC結(jié)果。
[0036] 圖21 :0saC4H催化反式肉桂酸形成的產(chǎn)物的HMBC結(jié)果。
[0037] 圖22:底物反式肉桂酸。
[0038] 圖23 :產(chǎn)物對香豆酸。
[0039] 圖24 :0sC4H分子進(jìn)化結(jié)果。
【具體實施方式】
[0040] 本發(fā)明通過如下實施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，這些實施例僅用于說明性的，而不是 以任何方式限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。
[0041] 實施例1虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組測序及序列分析
[0042] 提取虎眼萬年青無菌鱗莖總RNA后，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合 成第二條cDNA鏈，在經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加 EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、 加 poly (A)并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測序。
[0043] 測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，即raw data或raw reads。對raw reads進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，去掉帶接頭的，重復(fù)的，測序質(zhì)量很低的reads,得到 clean reads。使用短reads組裝軟件Trinity將具有一定長度overlap的clean reads連 成更長的片段，即Contig。然后，將clean reads比對回Contig，通過paired-end reads能 確定來自同一轉(zhuǎn)錄本的不同Contig以及這些Contig之間的距離，Trinity將這些Contig 連在一起，得到兩端不能再延長的序列，這些序列稱之為Unigene。通過blastx將Unigene 序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫nr、Swiss_Prot、KEGG和COG (evalue〈0. 00001)，并通過blastn將 Unigene比對到核酸數(shù)據(jù)庫nt(evalue〈0. 00001)，得到跟給定Unigene具有最高序列相似 性的蛋白，從而得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。
[0044] 通過功能注釋，從虎眼萬年青轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)一個長為1608bp的，具有肉桂 酸-4-輕化酶保守序列的 Unigene，即 Unigene26946 (SEQ ID NO. 3)。
[0045] 實施例20saC4H生物信息學(xué)分析
[0046] 利 用 Blast X (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast· cgi?PROGRAM=blastx&BLAST PR0GRAMS=blastx&PAGE TYPE=BlastSearch&SH0ff DEFAULTS=on&LINK L0C=blasthome)對所得的Unigene26946進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明該 Unigene中含有與肉桂酸-4-輕化酶（cinnamate4_hydroxylase)同源的編碼序列。利 用 NCBI ORF Finder( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)軟件對得到的 Unigene26946序列進(jìn)行ORF分析表明，該Unigene含有的最長ORF長度為1518bp，5'非 翻譯區(qū)為55bp，3'非翻譯區(qū)為35bp。對該ORF編碼蛋白序列相似性分析表明，該蛋白與 洋蔥（Allium cepa)的C4H(AAS48416. 1)的相似性最高為89%，其次為可可樹（Theobroma cacao，E0Y20175. 1)，撤攬（Canarium album，ACR10242. 1)，樹棉（Gossypium arboreum, MG10196. 1)，陸地棉（Gossypium hirsutum，ACZ06240. 1 和 ACH56520. 1)，葡萄柚（Citrus X paradisi，AAK57011. 1)和金銀花（Lonicera japonica，AGE10592. 1)。0saC4H 與這些 C4H 的相似性都是88% (圖1)。
[0047] 米用ExPASy Proteomics Sever提供的在線工具Protparam(http://www. expasy. ch/tools/protparam. html)對該ORF編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果表明該蛋白 由505個氨基酸組成，分子式為C2624H 4161N727O715S15，總原子數(shù)為8242,分子量為57. 8142kD ; 理論等電點（pi)為9. 22,帶正電殘基（Asp+Glu)為61，帶負(fù)電殘基（Arg+Lys)為70。該蛋 白的不穩(wěn)定系數(shù)為45. 70,表明該基因編碼的蛋白不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為100. 93,親水性系數(shù) 為-0· 202。
[0048] 米用 SWISS-MODEL (http://www. swissmodel. expasy. org/)進(jìn)行該基因編碼蛋白 二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測。其編碼蛋