專利名稱:一種改造基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種改造基因的方法，與傳統(tǒng)的方法相比，其可以用同一標(biāo)記對基因組進行復(fù)雜的改造，如多基因的滅活，外源基因的引入，或通過引入基因調(diào)控序列，對基因的表達進行調(diào)控。可以用于對基因組進行復(fù)雜的改造。
背景技術(shù)：
隨著對許多有機體包括病毒、細菌、真菌和人類的基因組序列測定的完成，為基因組有目的的人工改造提供了一種前所未有的機會。通過對已知微生物的人工改造，可以使微生物改善原有的性狀、獲得前所未有的性狀，以及通過對不同微生物的代謝途徑的人工整合，使人類獲得全新的微生物，為人類生產(chǎn)新的化工原料，分解各種環(huán)境污染物，提供新的能源和食品等。同時也可以通過對致病微生物的毒性因子的定向滅活，使其在具備誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫性保護作用的同時，失去使人體致病的能力。通過對真核生物的基因改造，使其能夠在保持其生物性狀的同時，延長其壽命等?？傊蚪M序列測定的完成，為人類研究、改造和利用生物有機體提供了前所未有的機會。
在自然的進化過程中，生物各種基因以及代謝途徑之間有著非常微妙的平衡關(guān)系，生物對其周圍環(huán)境有著準(zhǔn)確的感知和反應(yīng)，同時生物之間也有著相互的制約和控制。要到達對生物的基因組進行人工改造，則必須準(zhǔn)確把握這種關(guān)系。而準(zhǔn)確把握這種關(guān)系的關(guān)鍵所在為能夠?qū)λ枰獪缁罨蛞M的基因在染色體上進行精確的定位。
要將外源的基因引入生物體內(nèi)，必須有一種標(biāo)記使其能夠區(qū)分整合有外源基因的生物。最常見的為各種抗生素的耐藥基因，如氨芐青霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素和四環(huán)素等。加入抗生素耐藥基因可以幫助區(qū)分帶有外源基因的生物，但加入抗生素的耐藥基因可以造成耐藥性的擴散，同時由于目前各種抗生素種類有限，因此，如果不去掉抗生素耐藥基因，則僅能在一種生物體內(nèi)改造幾種基因。同時，要確保抗生索在生物體內(nèi)的表達，必須使抗生素耐藥基因的表達受控于來自生物體自身的強的促進子。
若要將外源基因引入生物體內(nèi)，必須在外源基因的兩側(cè)連接有來自生物體染色體且必須是在所需插入位點兩側(cè)的DNA序列。DNA序列的長度是越長越好，但根據(jù)所需插入的生物體種類不同，50-1000個堿基對就足以完成同源重組。這種同源序列可以確保外源基因插入到同源序列所限定的基因組的位點中。
一種基于大腸桿菌的λ噬菌體的基因重組系統(tǒng)，利用噬菌體編碼的核酸外切酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和可以抑制宿主降解噬菌體DNA的蛋白，再加上宿主的許多與DNA復(fù)制有關(guān)的蛋白的配合，可以有效地促進外源基因的整合。但這種系統(tǒng)僅能夠在大腸桿菌和傷寒桿菌中起作用，因為只有這二種細菌的蛋白能夠與噬菌體所編碼的蛋白相互作用。

發(fā)明內(nèi)容發(fā)明的目的為了克服目前利用λ噬菌體的基因重組系統(tǒng)方法只能在有限種類的細菌中進行基因改造的缺點，使其能夠更廣泛地應(yīng)用更多的細菌，特別是工業(yè)和醫(yī)學(xué)上重要的菌株的改造，生產(chǎn)人類需要的生物原料和疫苗，為本發(fā)明的目的。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，所采取的方案1、一種基因的染色體定向整合方法，其特征為在所需整合的基因兩側(cè)含有來自所需轉(zhuǎn)入的有機體染色體的同源序列，和一種可以促進基因定向整合并可在有機體內(nèi)去除的篩選標(biāo)記，且這種核酸序列可以直接轉(zhuǎn)入到有機體內(nèi)和通過特異性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到有機體內(nèi)。
2、權(quán)利要求
書1所述，在所需整合的基因的兩側(cè)的同源序列來自于所需整合的有機體的染色體，其長度為50-5000堿基對，最適長度為50-1000堿基對。
3、如權(quán)利要求
書2所述，所需整合的基因兩側(cè)的同源序列，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)，或分步克隆連接在一起。
4、如權(quán)利要求
書1所述，一種可以促進基因定向整合的篩選標(biāo)記可以為抗生素耐藥基因，營養(yǎng)缺陷型的互補基因，或重金屬抵抗基因。
5、如權(quán)利要求
書4所述，在篩選標(biāo)記的基因兩側(cè)含有特異性重組酶的辨認序列。
6、如權(quán)利要求
書1所述，所需要定向整合的基因、篩選標(biāo)記和同源序列所構(gòu)成的DNA片段可以通過質(zhì)粒或以DNA片段的形式轉(zhuǎn)化到有機體內(nèi)。
7、如權(quán)利要求
書1所述，在完成基因的染色體定向整合之后，可以將由來自有機體的強促進子控制的特異性重組酶的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到有機體內(nèi)，去除篩選標(biāo)記。
8、如權(quán)利要求
書1-7項所述的方法可以用于基因功能的滅活，基因功能的改造和調(diào)控。
具體實施方式谷氨酸棒狀桿菌是一種廣泛用于發(fā)酵工業(yè)的菌株，其不僅用于谷氨酸、賴氨酸等氨基酸的生產(chǎn)，也有人開始利用其進行酒精的發(fā)酵。在氨基酸的生產(chǎn)過程中，磷酸戊糖代謝通路提供了最基本的起始的化合物。因此，調(diào)節(jié)這一通路的代謝活性，對利用這一發(fā)酵工業(yè)菌株提高現(xiàn)有的氨基酸產(chǎn)量，或開發(fā)具有新的生產(chǎn)能力的菌株具有一定的意義。
6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸果糖，是葡萄糖進入糖酵解或磷酸戊糖通路的控制酶之一。如果將其在細菌的基因組上滅活，則可以使進入細菌的葡萄糖進入磷酸戊糖通路，這樣就可以提高相關(guān)的氨基酸的產(chǎn)量。
谷氨酸棒狀桿菌只能利用幾種有限的糖類作為其能源，其缺乏代謝木糖的關(guān)鍵酶，木糖異構(gòu)酶，其催化木糖到木酮糖的反應(yīng)。若在谷氨酸棒狀桿菌的基因組中引入木糖異構(gòu)酶，則可以利用秸稈等的降解產(chǎn)物來發(fā)酵氨基酸，或可以用于生產(chǎn)酒精等。
下面為本發(fā)明的應(yīng)用過程，首先是在基因組上滅活6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，然后是在基因組的同一位置引入來自大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶基因，說明如何利用本發(fā)明在滅活6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的同時引入木糖異構(gòu)酶。
1.谷氨酸棒狀桿菌乳酸脫氫酶促進子的克隆1.1根據(jù)已經(jīng)公布的谷氨酸棒狀桿菌的基因組序列，首先設(shè)計了下面一對聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，用于擴增乳酸脫氫酶促進子上下游的基因序列序列15’TAAAGCCAGCGCCCATATTTGCAG3’序列25’AATGACAACCATGGCTGCGTCTTC3’然后建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X Taq DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列1 5.0uL2uM序列2 5.0uL10ng/ul谷氨酸棒狀桿菌染色體DNA 5.0uL5u/ulTaq DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)
94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從瓊脂糖凝膠上回收652bp的DNA片斷，并將溶于去離子水中，使其濃度為1ng/uL。
1.2根據(jù)已經(jīng)公布的谷氨酸棒狀桿菌的基因組序列，設(shè)計了一對PCR引物，用于擴增乳酸脫氫酶基因的促進子，并使序列3含有限制性內(nèi)切酶Nsil，Mlul和特異性的重組酶的辨認序列，以及使序列4含有限制性內(nèi)切酶Ndel的辨認序列序 列 3 5’GGATCCATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACT A GCTCTGCAATGACCTG3’序列45’GGATCC CATATG CGATCCCACTTCCTGATTTCCCTAA3’然后利用1.1所得的DNA片斷為模板，建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X Taq DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列3 5.0uL2uM序列4 5.0uL1ng/ul得自步驟1.1的DNA片斷 5.0uL5u/ulTaq DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從瓊脂糖凝膠上回收395bp的DNA片斷，并溶于30uL得去離子水中。
1.3將步驟1.2所得的DNA片斷通過下列緩沖系統(tǒng)分別用NsiI和NdeI酶切，并連接于用同樣酶切處理的克隆載體pGEM-T中。
1.3.110 X NEB緩沖液3 5.0uL395bp得自步驟1.2的DNA片斷 30.0uL10u/ul Nsil 2.0uL去離子水 13.0uL和10 X NEB緩沖液3 5.0uLpGEM-T 100ng/ul 30.0uL10u/ul Nsil 2.0uL去離子水 13.0uL37℃ 4小時。
然后用Qiagen公司生產(chǎn)的PCR純化試劑盒純化上述的酶切反應(yīng)物，并分別洗脫于30uL的去離子水中。然后，再進行下列的反應(yīng)1.3.210 X NEB緩沖液4 5.0uL395bp得自步驟1.3.1的DNA片斷 30.0uL
10u/ul Ndel 2.0uL去離子水 13.0uL10 X NEB緩沖液4 5.0uLpGEM-T得自步驟1.3.1 30.0uL10u/ul Ndel 2.0uL去離子水 13.0uL37℃ 4小時。
1.3.3從1％瓊脂糖凝膠上分別回收1.3.2的PCR和pGEM-T的酶切片斷，并通過下列體系將二者連接在一起10 X NEB T4 DNA連接酶緩沖液 2.0uLPCR片斷 12.0uLPGEM-T 5.0uL200u/ul T4 DNA連接酶 1.0uL16℃ 12小時。
1.3.4.向步驟1.3.3的反應(yīng)產(chǎn)物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸鈉，加入80uL的無水酒精，混勻后，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，于空氣中干燥10分鐘后，溶于10uL的去離子水中。
1.3.5將步驟1.3.4的反應(yīng)產(chǎn)物5uL加入到95uL的大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細胞中，置入冰浴中30分鐘，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分鐘，加入1毫升的LB細菌培養(yǎng)液，并于37℃培養(yǎng)1小時。然后分別將100uL和900uL的培養(yǎng)液涂抹在含有氨芐青霉素和X-Gal的培養(yǎng)基上，于37℃生長14-16小時。
1.3.6從步驟1.3.5的培養(yǎng)皿上挑取單個白色的菌落，于氨芐青霉素的LB細菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)過酶切和測序，將其命名為pBJSZ129，其整個DNA序列編號為序列5，見序列列表第1頁。
2.將氯霉素的抗性基因克隆pBJSZ129質(zhì)粒中2.1根據(jù)已知的pACYC184質(zhì)粒的序列，設(shè)計下列PCR引物用于擴增氯霉素的抗性基因，并使序列6含有限制性內(nèi)切酶Ndel的辨認序列，序列7含有特異性的重組酶的辨認序列以及限制性內(nèi)切酶Apal的辨認序列。
序列65’GGATCCCATATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACC3’序列75’GGATCCGGGCCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGTTAC GCCCCGCCCTGCCAC3’然后建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X Taq DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列6 5.0uL2uM序列7 5.0uL10ng/ul pACYC184 DNA 5.0uL5u/ulTaq DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒
72℃ 30秒循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從瓊脂糖凝膠上回收726bp的DNA片斷，并溶于30uL的去離子水中。
2.2將步驟2.1所得的氯霉素耐藥基因的DNA片斷和pBJZH129質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeI和ApaI通過下列系統(tǒng)進行酶切處理10 X NEB緩沖液系統(tǒng)4 5.0uL氯霉素耐藥基因片斷 30.0uLNdeI 10u/ul 2.0uLApaI 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL去離子水 10.5uL10 X NEB緩沖液系統(tǒng)4 5.0uLpBJSZ129(100ng/ul) 30.0uLNdeI 10u/ul 2.0uLApaI 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL去離子水 10.5uL于37℃反應(yīng)4小時。
2.3從1％瓊脂糖凝膠上分別回收氯霉素耐藥基因和pBJSZ129的酶切片斷，并通過下列體系將二者連接在一起10 X NEB T4 DNA連接酶緩沖液 2.0uL氯霉素耐藥基因片斷 12.0uLpBJSZ129 5.0uL200u/ul T4 DNA連接酶 1.0uL于16℃反應(yīng)12小時。
2.4.向步驟2.3的反應(yīng)產(chǎn)物中加入5uL 5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸鈉，加入80uL的無水酒精，混勻后，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，于空氣中干燥10分鐘后，溶于10uL的去離子水中。
2.5將步驟2.4的反應(yīng)產(chǎn)物5uL加入到95uL的大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細胞中，置入冰浴中30分鐘，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分鐘，加入1毫升的LB細菌培養(yǎng)液，并于37℃培養(yǎng)1小時。然后分別將100uL和900uL的培養(yǎng)液涂抹在含有氯霉素的培養(yǎng)基上，于37℃生長18-20小時。
2.6從步驟2.5的培養(yǎng)基上挑取單個菌落，于氯霉素的LB細菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)過酶切和測序，將其命名為pBJSZ130，其完整的DNA序列為序列8，見序列列表第2頁2.7根據(jù)pBJSZ130的序列，設(shè)計了一對可以用于擴增包括重組酶特異性的辨認序列、乳酸脫氫酶促進子和氯霉素耐藥基因的通用PCR引物。該PCR產(chǎn)物將用于步驟3的重疊PCR.
序列95’ACGCCAAGCTATTTAGGTGACACT3’序列105’GATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT3’然后建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X KOD XL DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列9 5.0uL2uM序列10 5.0uL
10ng/ul pBJSZ1 30DNA 5.0uL2.5u/ul KOD XL DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 60秒循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從瓊脂糖凝膠上回收1249bp的DNA片斷，并溶于50uL的去離子水中。其DNA序列為序列11，見序列列表第3頁。
3.谷氨酸棒狀桿菌6-磷酸葡萄糖脫氫酶同源序列的克隆3.1根據(jù)已經(jīng)公布的谷氨酸棒狀桿菌的基因組序列，設(shè)計了下列二隊PCR引物，分別用于擴增6-磷酸葡萄糖脫氫酶的上游和下游的同源基因序列，并使其中的序列13和序列14的5’端含有分別與序列9和10互補的序列，和序列13含有限制性內(nèi)切酶Mlul和Sacll的辨認序列，以及序列12和序列15含有限制性內(nèi)切酶Notl的特異性的辨認序列。
序列125’GGATCCGAATTC GCGGCCGC ATCAGCACCGACAAACACGATCCT3’序列135’AGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTACGCGTTGGCCACCGCGGAGTGGTTGCCTGGAA GTTTGAGTA3’序列145’ACCCTGGCGTTACCCAACTTAATC TGGGACATCAACTCCTTCGACCAA3’序列155’GGATCCGAATTC GCGGCCGC ACTCCCTAACAGCAATCGGAAGCA3’然后建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X KOD XL DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列12 5.0uL2uM序列13 5.0uL10ng/ul谷氨酸棒狀桿菌染色體DNA 5.0uL2.5u/ul KOD XL DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL和10 X KOD XL DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列14 5.0uL2uM序列15 5.0uL10ng/ul谷氨酸棒狀桿菌染色體DNA 5.0uL2.5u/ul KOD XL DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 60秒循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從1％的瓊脂糖凝膠上分別回收649bp和580bp的DNA片斷，并溶于50uL的去離子水中。其中上游同源序列為序列16，見序列列表第3頁；下游同源序列為序列17，見序列列表第3頁。
3.2利用重疊PCR將步驟2.7所得的由乳酸脫氫酶促進子控制的氯霉素耐藥基因和步驟3.1所得的6-磷酸葡萄糖脫氫酶的上游和下游同源序列連接在一起。
建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X KOD XL DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列12 5.0uL2uM序列15 5.0uL序列11 3.0uL序列16 3.0uL序列17 3.0uL2.5單位/uLKOD XL DNA聚合酶 0.5uL去離子水 19.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 3分鐘循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從1％的瓊脂糖凝膠上回收2495bp的DNA片斷，并溶于50uL的去離子水中。其DNA序列為序列18，見序列列表第3頁。
3.3將序列18和pBJSZ82質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶NotI在下列系統(tǒng)中進行酶切處理；10 X NEB緩沖液系統(tǒng)3 6.0uL序列18 DNA片斷 50.0uLNotI 10u/ul 2.0uL100X BSA 0.5uL去離子水 1.5uL和10 X NEB緩沖液系統(tǒng)3 6.0uLpBJSZ82 20ng/ul 50.0uLNotI 10u/ul 2.0uL100X BSA 0.5uL去離子水 1.5uL37℃反應(yīng)4小時，然后在pBJSZ82的反應(yīng)液中加入1uL的小牛腸道堿性磷酸酶，再在37℃反應(yīng)1小時。
然后從1％瓊脂糖凝膠上分別回收序列18和pBJSZ82的酶切片斷，并通過下列體系將二者連接在一起10 X NEB T4 DNA連接酶緩沖液 2.0uL氯霉素耐藥基因片斷 12.0uLpBJSZ129 5.0uL200u/ul T4 DNA連接酶 1.0uL于16℃反應(yīng)12小時。
3.4.向步驟3.3的反應(yīng)產(chǎn)物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸鈉，加入80uL的無水酒精，混勻后，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，于空氣中干燥10分鐘后，溶于10uL的去離子水中。
3.5將步驟2.4的反應(yīng)產(chǎn)物5uL加入到95uL的大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細胞中，置入冰浴中30分鐘，然后再置入42℃的水浴中90秒，加入1毫升的LB細菌培養(yǎng)液，并于37℃培養(yǎng)1小時。然后分別將100uL和900uL的培養(yǎng)液涂抹在含有氯霉素的培養(yǎng)基上，于37℃生長18-20小時。
3.6從步驟3.5的培養(yǎng)基上挑取單個菌落，于氯霉素的LB細菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)過酶切和測序，將其命名為pBJSZ133。其DNA序列為序列19，見序列列表第4頁。
4.大腸桿菌木糖異構(gòu)酶基因的克隆4.1根據(jù)已公布的大腸桿菌的基因組序列設(shè)計了下面一對引物用于擴增包括木糖異構(gòu)酶基因在內(nèi)的一段DNA序列序列205’ATCACCCGCGGCATTACCTGATTA3’序列215’CTTTCATTGCGCGATCAGTTGCCT3’建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X KOD XL DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列20 5.0uL2uM序列21 5.0uL10納克/uL的大腸桿菌染色A 5.0uL2.5單位/uLKOD XL DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從1％的瓊脂糖凝膠上回收1601bp的DNA片斷，并溶于50uL的去離子水中。
4.2根據(jù)已公布的大腸桿菌的基因組序列設(shè)計了下面一對引物用于擴增木糖異構(gòu)酶的編碼基因序列，并使序列22含有限制性內(nèi)切酶NdeI和序列23含有限制性內(nèi)切酶Sacll的辨認序列序列225’GGATCCCAT ATGCAAGCCTATTTTGACCAGCTC3’序列235’GGATCCCCGCGGTCTGGTAAACCATTATCTGTTCGACAAATAA3’建立如下的PCR反應(yīng)體系10 X KOD XL DNA聚合酶緩沖液 5.0uL2mM dNTP 5.0uL2uM序列22 5.0uL2uM序列23 5.0uL得自步驟4.1的PCR片斷 5.0uL2.5單位/uLKOD XL DNA聚合酶 0.5uL去離子水 24.5uL混勻后，在基因擴增儀上進行下列反應(yīng)94℃ 2分鐘，然后94℃ 15秒55℃ 15秒72℃ 30秒循環(huán)30次，最后在72℃延伸10分鐘。
從1％的瓊脂糖凝膠上回收1347bp的DNA片斷，并溶于50uL的去離子水中。其DNA序列為序列24，見序列列表第5頁。
4.3通過酶切和連接反應(yīng)將序列24克隆到pBJSZ129質(zhì)粒中4.3.1建立如下的酶切反應(yīng)體系10 X NEB緩沖液系統(tǒng)4 6.0uL序列24 DNA片斷 49.5uLNdeI 10u/ul 2.0uLSacII 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL和10 X NEB緩沖液系統(tǒng)4 6.0uLpBJSZ129 50ng/ul 49.5uLNdeI 10u/ul 2.0uLSacII 10u/ul 2.0uL100 X BSA 0.5uL于37℃反應(yīng)4小時。
4.3.2從1％瓊脂糖凝膠上分別回收序列24和pBJSZ129的酶切片斷，并通過下列體系將二者連接在一起10 X NEB T4 DNA連接酶緩沖液 2.0uL序列24的基因片斷 12.0uLpBJSZ129 5.0uL200u/ul T4 DNA連接酶 1.0uL于16℃反應(yīng)12小時。
4.3.3向步驟4.3.2的反應(yīng)產(chǎn)物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸鈉，加入80uL的無水酒精，混勻后，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，于空氣中干燥10分鐘后，溶于10uL的去離子水中。
4.3.4將步驟4.3.2的反應(yīng)產(chǎn)物5uL加入到95uL的大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細胞中，置入冰浴中30分鐘，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分鐘，加入1毫升的LB細菌培養(yǎng)液，并于37℃培養(yǎng)1小時。然后分別將100uL和900uL的培養(yǎng)液涂抹在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，于37℃生長14-16小時。
4.3.5從步驟4.3.4的培養(yǎng)基上挑取單個菌落，于氨芐青霉素的LB細菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)過酶切和測序，將其命名為pBJSZ134。其DNA序列為序列25，見序列列表第6頁。
5.將在乳酸脫氫酶促進子控制下的木糖異構(gòu)酶連接到6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶同源序列所在的質(zhì)粒pBJSZ133中(序列19)，構(gòu)建新的質(zhì)粒pBJSZ135，以達到滅活6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的同時，引入外源基因木糖異構(gòu)酶。
5.1用限制性內(nèi)切酶Mlul和Sacll分別消化pBJSZ133(序列19)和pBJSZ134(序列25)10 X NEB緩沖液3 5.0uL序列19 500ng/ul 5.0uLMlul 10u/ul 2.5uL去離子水 37.5uL和10 X NEB緩沖液3 5.0uL序列25 500ng/ul 10.0uLMlul 10u/ul 5.0uL去離子水 30.0uL
于37℃反應(yīng)4小時。然后用酚/氯仿抽提酶切反應(yīng)物，加入10uL3M醋酸鈉，150uL的無水酒精，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，棄上清，加入70％的酒精再離心15分鐘，棄上清。于空氣中干燥10分鐘。然后，再建立下列反應(yīng)體系10 X NEB緩沖液4 5.0uLMlul消化的序列19 5.0uLSacll 10u/ul 2.5uL去離子水 37.5uL和10 X NEB緩沖液3 5.0uLMlul消化的序列25 5.0uLSacll 10u/ul 5.0uL去離子水 35.0uL于37℃反應(yīng)4小時。然后從1％瓊脂糖凝膠上分別回收序列19和從序列25中釋放出來的1725bp的酶切片斷，并通過下列體系將二者連接在一起10 X NEB T4 DNA連接酶緩沖液 2.0uL序列25中釋放的1725bp的基因片斷 12.0uL序列19 5.0uL200u/ul T4 DNA連接酶 1.0uL于16℃反應(yīng)12小時。
5.2向步驟5.1的反應(yīng)產(chǎn)物中加入5uL5ug/uL的酵母tRNA，加入4uL3M的醋酸鈉，加入80uL的無水酒精，混勻后，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，并加入70％的酒精500uL，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄掉上清，于空氣中干燥10分鐘后，溶于10uL的去離子水中。
5.3將步驟5.2的反應(yīng)產(chǎn)物5uL加入到95uL的大腸桿菌DH5a的感受態(tài)細胞中，置入冰浴中30分鐘，然后再置入42℃的水浴中90秒，于冰浴中放置3分鐘，加入1毫升的LB細菌培養(yǎng)液，并于37℃培養(yǎng)1小時。然后分別將100uL和900uL的培養(yǎng)液涂抹在含有氯霉素的培養(yǎng)基上，于37℃生長18-20小時。
5.4從步驟5.3的培養(yǎng)基上挑取單個菌落，于含有氯霉素的LB細菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)，經(jīng)酶切和序列測定，獲得的質(zhì)粒為pBJSZ135。其序列為序列26，見序列列表第7頁。
6.序列27為溫度敏感性的表達特異性重組酶的質(zhì)粒，被命名為pBJSZ83。其序列見序列列表第9頁。
7.將pBJSZ133(序列19)電轉(zhuǎn)到谷氨酸棒狀桿菌sBJSZ105中，并對染色體整合產(chǎn)物進行鑒定7.1從營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上提取單個菌落，并接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中于37℃培養(yǎng)16個小時，然后1∶50稀釋，再于37℃培養(yǎng)3-4小時。離心收集細菌，用無菌去離子水洗二遍，然后懸浮在15％的甘油中。
7.2在離心管中加入序列19 20ug，在2500伏，用間隙為0.2厘米的電轉(zhuǎn)杯經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)入到細菌中，立即加入肉湯營養(yǎng)液，并涂抹在含有氯霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。
7.3挑取單個菌落在含有氯霉素的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中于37℃培養(yǎng)16個小時，然后再1∶1000稀釋于37℃培養(yǎng)16個小時后，最后涂抹在含有氯霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。
7.4挑取單個菌落，用序列12和序列15做引物，進行PCR反應(yīng)，野生株會得到2534bp的產(chǎn)物，而變異株則得到2454bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，用NdeI酶切處理，野生株仍為2534bp，變異株則得到1091bp和1403bp的二個片斷。
7.5將明確發(fā)生變異的單個菌株于肉湯培養(yǎng)液中在37℃培養(yǎng)16個小時，然后1∶50稀釋，再于37℃培養(yǎng)3-4小時。離心收集細菌，用無菌去離子水洗二遍，然后懸浮在15％的甘油中。
7.6在離心管中加入溫度敏感的編碼特異性重組酶的pBJSZ83(序列27)0.5ug，在2500伏，用間隙為0.2厘米的電轉(zhuǎn)杯經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)入到細菌中，立即加入肉湯營養(yǎng)液，并涂抹在含有氨芐青霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)20小時。
7.7將單個菌落分別對稱有序地涂抹在不含和含有氯霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。對氯霉素敏感的菌落，表明特異性的重組酶已經(jīng)將氯霉素耐藥基因切除。
7.8將氯霉素敏感的單個菌落于肉湯培養(yǎng)液中在37℃培養(yǎng)4個小時，然后涂抹在不含抗生素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于42℃過夜培養(yǎng)。
7.9將單個菌落分別對稱有序地涂抹在不含和含有青霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。對青霉素敏感的菌落，表明細菌已經(jīng)丟失了表達特異性重組酶的質(zhì)粒。而該細菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶已經(jīng)被滅活。
8.將pBJSZ135(序列26)電轉(zhuǎn)到谷氨酸棒狀桿菌sBJSZ105中，并對染色體整合產(chǎn)物進行鑒定8.1從營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上提取單個菌落，并接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中于37℃培養(yǎng)16個小時，然后1∶50稀釋，再于37℃培養(yǎng)3-4小時。離心收集細菌，用無菌去離子水洗二遍，然后懸浮在15％的甘油中。
8.2在離心管中加入序列26 20ug，在2500伏，用間隙為0.2厘米的電轉(zhuǎn)杯經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)入到細菌中，立即加入肉湯營養(yǎng)液，并涂抹在含有氯霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。
8.3挑取單個菌落在含有氯霉素的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中于37℃培養(yǎng)16個小時，然后再1∶1000稀釋于37℃培養(yǎng)16個小時后，最后涂抹在含有氯霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。
8.4挑取單個菌落，用序列12和序列15做引物，進行PCR反應(yīng)，野生株會得到2534bp的產(chǎn)物，而變異株則得到4156bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，用NdeI酶切處理，野生株仍為2534bp，變異株則得到852bp，1377bp和1927bp的三個片斷。
8.5將明確發(fā)生變異的單個菌株于肉湯培養(yǎng)液中在37℃培養(yǎng)16個小時，然后1∶50稀釋，再于37℃培養(yǎng)3-4小時。離心收集細菌，用無菌去離子水洗二遍，然后懸浮在15％的甘油中。
8.6在離心管中加入溫度敏感的編碼特異性重組酶的pBJSZ83(序列27)0.5ug，在2500伏，用間隙為0.2厘米的電轉(zhuǎn)杯經(jīng)電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)入到細菌中，立即加入肉湯營養(yǎng)液，并涂抹在含有氨芐青霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)20小時。
8.7將單個菌落分別對稱有序地涂抹在不含和含有氯霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。對氯霉素敏感的菌落，表明特異性的重組酶已經(jīng)將氯霉素耐藥基因切除。
8.8將氯霉素敏感的單個菌落于肉湯培養(yǎng)液中在37℃培養(yǎng)4個小時，然后涂抹在不含抗生素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于42℃過夜培養(yǎng)。
8.9將單個菌落分別對稱有序地涂抹在不含和含有青霉素的肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。對青霉素敏感的菌落，表明細菌已經(jīng)丟失了表達特異性重組酶的質(zhì)粒。
8.10挑取單個菌落，用序列12和序列15做引物，進行PCR反應(yīng)，野生株會得到2534bp的產(chǎn)物，而變異株則得到3050bp的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化，用NdeI酶切處理，野生株仍為2534bp，變異株則得到1123bp和1927bp的二個片斷。則表明該菌株在6-磷酸葡萄糖脫氫酶被滅活的同時也置換入了木糖異構(gòu)酶的基因。
一種改造基因的方法序列15’TAAAGCCAGCGCCCATATTTGCAG3’序列25’AATGACAACCATGGCTGCGTCTTC3’序列35’GGATCCATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACTAGCTCTGCAATGACCTG3’序列45’GGATCC CATATG CGATCCCACTTCCTGATTTCCCTAA3’序列55’TATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACTAGCTCTGCAATGACCTGCGCGCCGAGGGAGGCGAGGTGGGTGGCAGGTTTTAGTGCGGGTTTAAGCGTTGCCAGGCGAGTGGTGAGCAGAGACGCTAGTCTGGGGAGCGAAACCATATTGAGTCATCTTGGCAGAGCATGCACAATTCTGCAGGGCATAGGTTGGTTTTGCTCGATTTACAATGTGATTTTTTCAACAAAAATAACACTTGGTCTGACCACATTTTCGGACATAATCGGGCATAATTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGCTCTTGCTGATTTTCTGAGCTGCTTTGTGGGTTGTCCGGTTAGGGAAATCAGGAAGTGGGATCGCATATGGTCGACCTGCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATATCGAATTCCCGCGGCCGC
CATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCC3’序列65’GGATCCCATATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACC3’序列75’GGATCCGGGCCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGAATAGGTTACGCCCCGCCCTGCCAC3’序列85’TATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTATTTAGGTGACACTATAGAATACTCAAGCTATGCATACGCGTGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCCGGAACTAGCTCTGCAATGACCTGCGCGCCGAGGGAGGCGAGGTGGGTGGCAGGTTTTAGTGCGGGTTTAAGCGTTGCCAGGCGAGTGGTGAGCAGAGACGCTAGTCTGGGGAGCGAAACCATATTGAGTCATCTTGGCAGAGCATGCACAATTCTGCAGGGCATAGGTTGGTTTTGCTCGATTTACAATGTGATTTTTTCAACAAAAATAACACTTGGTCTGACCACATTTTCGGACATAATCGGGCATAATTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGCTCTTGCTGATTTTCTGAGCTGCTTTGTGGGTTGTCCGGTTAGGGAAATCAGGAAGTGGGATCGCATATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGG
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權(quán)利要求
1.一種基因的染色體定向整合方法，其特征為在所需整合的基因兩側(cè)含有來自所需轉(zhuǎn)入的有機體染色體的同源序列，和一種可以促進基因定向整合并可在有機體內(nèi)去除的篩選標(biāo)記，且這種核酸序列可以直接轉(zhuǎn)入到有機體內(nèi)和通過特異性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到有機體內(nèi)。
2.權(quán)利要求
書1所述，在所需整合的基因的兩側(cè)的同源序列來自于所需整合的有機體的染色體，其長度為50-5000堿基對，最適長度為50-1000堿基對。
3.如權(quán)利要求
書2所述，所需整合的基因兩側(cè)的同源序列，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)，或分步克隆連接在一起。
4.如權(quán)利要求
書1所述，一種可以促進基因定向整合的篩選標(biāo)記可以為抗生素耐藥基因，營養(yǎng)缺陷型的互補基因，或重金屬抵抗基因。
5.如權(quán)利要求
書4所述，在篩選標(biāo)記的基因兩側(cè)含有特異性重組酶的辨認序列。
6.如權(quán)利要求
書1所述，所需要定向整合的基因、篩選標(biāo)記和同源序列所構(gòu)成的DNA片段可以通過質(zhì)?；蛞訢NA片段的形式轉(zhuǎn)化到有機體內(nèi)。
7.如權(quán)利要求
書1所述，在完成基因的染色體定向整合之后，可以將由來自有機體的強促進子控制的特異性重組酶的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到有機體內(nèi)，去除篩選標(biāo)記。
8.如權(quán)利要求
書1-7項所述的方法可以用于基因功能的滅活，基因功能的改造和調(diào)控。
專利摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種可以在體內(nèi)被特異性的重組酶所辨認的序列，將其利用人工合成的方法加入到篩選標(biāo)記的兩端，再將所需要插入的基因及其來自生物體的所需插入點兩側(cè)的同源序列，一并通過聚合酶鏈反應(yīng)或分步克隆到質(zhì)粒中，將聚合酶鏈反應(yīng)片段或質(zhì)粒轉(zhuǎn)到生物體內(nèi)，在獲得所需要的生物體性狀后，可以將來自生物體的強促進子控制下的、表達特異性重組酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到生物體內(nèi)，將整合到染色體中的篩選標(biāo)記切除。這樣，就可以利用同一標(biāo)記對生物體進行反復(fù)的基因修改如整個代謝途徑的加入等，而達到對生物體進行復(fù)雜改造的目的。本發(fā)明可以用于生物體的基因組改造。
文檔編號C12N15/87GK1995342SQ200610137932
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月1日
發(fā)明者劉吉榮, 遲云發(fā) 申請人:北京神洲天才科技發(fā)展有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan