專利名稱:固相多肽合成縮宮素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及縮宮素的制備方法，具體涉及固相多肽合成縮宮素的制備方法。
背景技術(shù)：
縮宮素，又稱催產(chǎn)素，英文名為Oxytocin，結(jié)構(gòu)式 分子式為C43H66N12O12S2，分子量為1007.2。
縮宮素為多肽類激素子宮收縮藥。具有如下的功能(1)刺激子宮平滑肌收縮，模擬正常分娩的子宮收縮作用，導(dǎo)致子宮頸擴(kuò)張，子宮對(duì)縮宮素的反應(yīng)在妊娠過(guò)程中逐漸增加，足月時(shí)達(dá)高峰。(2)刺激乳腺的平滑肌收縮，有助于乳汁自乳房排出，但并不增加乳腺的乳汁分泌量。肌內(nèi)注射后3～5分鐘起效，作用持續(xù)30～60分鐘；靜脈滴注立即起效，15～60分鐘內(nèi)子宮收縮的頻率與強(qiáng)度逐漸增加，然后穩(wěn)定滴注完畢后20分鐘，其效應(yīng)漸減退。T1/2一般為1～6分鐘。本品經(jīng)肝、腎代謝，經(jīng)腎排泄，極少量是原形物。臨床用于引產(chǎn)、催產(chǎn)、產(chǎn)后及流產(chǎn)后因?qū)m縮無(wú)力或縮復(fù)不良而引起的子宮出血。
縮宮素最早由中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所研發(fā)，目前的縮宮素的制備方法均為液相合成法，采用芐氧羰酰(Cbz)路線，如文獻(xiàn)Bodansky M.and du Vigneand V.J.Amer.Chem.Soc.，81，5688(1959)公開(kāi)的方法，也有報(bào)導(dǎo)采用固相合成Boc路線，如文獻(xiàn)“生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1976年6月，第8卷，第2期，第121-128頁(yè)”公開(kāi)的方法，該方法以Boc-Gly-氯甲基樹(shù)脂為起始原料，依次接上Boc-Leu、Boc-Pro、Boc-Cys(Bzl)、Boc-Asn、Boc-Gln、Boc-Ile、Boc-Tyr(Bzl)、Boc-Cys(Bzl)，再經(jīng)氨解、鈉氨、氧化等反應(yīng)制得縮宮素。由于該工藝三廢較嚴(yán)重，收率也較低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，不具備規(guī)模生產(chǎn)能力，工藝復(fù)雜，成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重，質(zhì)量較差，不能滿足臨床的需要。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種固相多肽合成縮宮素的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的方法包括如下步驟以Rink Amide樹(shù)脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH；然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品；加入堿性物質(zhì)，在pH為7.5-10.0的條件下通入空氣、雙氧水或DMSO氧化，獲得氧化型粗品；最后采用C18柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方案以Rink Amide樹(shù)脂，包括Rink Amide MBHA樹(shù)脂或Rink AmideAM樹(shù)脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH的方法包括如下步驟(1)Rink Amide樹(shù)脂的預(yù)處理將Rink Amide樹(shù)脂(0.93mmol/g)用DMF浸泡10～60分鐘，使樹(shù)脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈桑尤肓鶜溥拎さ腄MF溶液，15～45℃反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯等チ鶜溥拎?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(A)；
六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為10～50％；六氫吡啶的DMF溶液中，Rink Amide樹(shù)脂的重量濃度為5～20％；(2)Fmoc-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(1)的(A)加入Fmoc-Gly-OH(MW297.3)、TBTU或HBTU(MW321)、HOBT(MW153.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，(A)的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；(3)Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(2)的Fmoc-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑尤隖moc-Leu-OH(MW353.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，F(xiàn)moc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(2)的Fmoc-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(4)Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備
將步驟(3)的Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加入Fmoc-Por-OH(MW337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(3)的Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Por-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(5)Fmoc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(4)的Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(4)的Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；
六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(5)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Gln(Trt)-OH(MW610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(6)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(8)Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Ile-OH(FW353.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(7)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Ile-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(8)的Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑猾@得Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(8)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，15～45℃脫帽反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，15～40℃接肽反應(yīng)0.5～5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；
NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15；NMM和DMF中，步驟(9)的樹(shù)脂重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，加入切肽試劑進(jìn)行切肽包括如下步驟將上述保護(hù)的9肽樹(shù)脂加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，15～35℃反應(yīng)1.5～5小時(shí)，過(guò)濾，濾液加乙醚沉淀，獲得還原型粗品；保護(hù)的9肽樹(shù)脂在切肽試劑中的重量體積比為5～20ml/g；按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，還原型粗品氧化(二硫鍵的形成)的方法包括如下步驟將還原型粗品溶于水中，在攪拌下緩慢加入0.5～1.5mol/L的氨水或NaOH或KOH，調(diào)節(jié)pH至7.5-10.0，通入空氣、雙氧水氧化或DMSO等氧化劑，于10-50℃攪拌氧化至還原型消失，過(guò)濾，收集濾液；按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，純化包括如下步驟濾液經(jīng)C18或C8柱柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1，體積比)；流速為100-650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后采用常規(guī)的方法凍干，獲得目標(biāo)產(chǎn)物?？偸章始s為27％。
由上述公開(kāi)的技術(shù)方案可見(jiàn)，本發(fā)明的方法，采用Rink Amide樹(shù)脂(包括Rink Amide MBHA樹(shù)脂、Rink AmideAM樹(shù)脂)為起始原料，每步接肽收率≥99％，最后一個(gè)肽鏈采用Boc-Gly-OH，簡(jiǎn)化了工藝，降低了生產(chǎn)成本，采用切肽試劑(TFA/EDT/H2O/TIS)進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少，切肽收率高達(dá)92％，采用弱堿性氧化(pH7.5-10.0)的方法，氧化收率高，反應(yīng)時(shí)間短，采用C18(或C8)柱進(jìn)行分離純化，避免使用三氟乙酸，減少三廢，純化收率高達(dá)40％，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率為92％，分離純化收率為25％，總收率約為21％。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的方法生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，收率高，便于工業(yè)化實(shí)施。
具體實(shí)施方式實(shí)施例和前述過(guò)程中所采用的原料列表如下
實(shí)施例1肽鏈制備溶脹和脫帽稱取Rink Amide樹(shù)脂50克(200目，0.93mmol/g，46.5mmol)，用800mlDMF浸泡30分鐘，使樹(shù)脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈?。加?00毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯禐V去六氫吡啶，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Gly-樹(shù)脂的制備加Fmoc-Gly-OH(MW297.3，186mmol)55.3g，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153.1，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備加入500毫升20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加Fmoc-Leu-OH(MW353.4，186mmol)65.7g，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBt(MW153.1，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備加入500毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加Fmoc-Por-OH(MW337.4，186mmol)62.8g，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153.1，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400ml DMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備加入500毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加108.9g(585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備加入500毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加111.0g(596.7，186mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑珼MF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備加入500毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加113.6g(610.7，186mmol)Fmoc-Gln(Trt)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備
加入500毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加65.7g(FW353.4，186mmol)Fmoc-Ile-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM41.4ml(MW＝101.2)，400mlDME，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備加入500毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 加75.0g(403.4，186mmol)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備加入500毫升重量濃度為20％六氫吡啶的DMF溶液，25℃振搖30分鐘。氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、無(wú)水甲醇DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞＜?08.9g(FW585.7，186mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH，TBTU或HBTU(MW321，186mmol)59.7g，HOBT(MW153，186mmol)32.7g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，將混合物25℃振搖1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，氮?dú)獯蹈伞?br> 再用無(wú)水甲醇洗滌三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得保護(hù)9肽樹(shù)脂。
切肽保護(hù)的9肽樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到切肽瓶中，冷卻下，邊攪拌邊加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，25℃攪拌2小時(shí)。過(guò)濾，抽干，濾液加無(wú)水乙醚沉淀。
氧化(二硫鍵的形成)將還原型縮宮素粗品溶于純化水中，在攪拌下緩慢加入1mol/L氨水，調(diào)節(jié)PH至8，通入空氣或雙氧水，攪拌過(guò)夜，采用HPLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程，至還原型縮宮素消失，過(guò)濾，獲得氧化型縮宮素粗品溶液；純化濾液經(jīng)C18柱(10×30cm)純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac∶乙腈(9∶1，體積比)；流速為300ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后凍干，獲得12.5g目標(biāo)產(chǎn)物，總收率約為27％。
權(quán)利要求
1.一種固相多肽合成縮宮素的制備方法，其特征在于，包括如下步驟以Rink Amide樹(shù)脂，包括Rink Amide MBHA樹(shù)脂或Rink Amide AM樹(shù)脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸；然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品；加入堿性物質(zhì)，在pH為7.5-10.0的條件下通空氣氧化或用雙氧水進(jìn)行氧化，獲得氧化型粗品；最后采用C18或C8柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，以Rink Amide樹(shù)脂，包括Rink Amide MBHA樹(shù)脂或Rink AmideAM樹(shù)脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸的方法包括如下步驟(1)Rink Amide樹(shù)脂，包括Rink Amide MBHA樹(shù)脂或Rink AmideAM樹(shù)脂的預(yù)處理將Rink Amide樹(shù)脂用DMF浸泡10～60分鐘，使樹(shù)脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈?，加入六氫吡啶的DMF溶液，20～30℃反應(yīng)10～60分鐘，氮?dú)獯等チ鶜溥拎ぃ謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為15～25％；六氫吡啶的DMF溶液中，Rink Amide樹(shù)脂的重量濃度為5～15ml/g；(2)Fmoc-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(1)的預(yù)處理的樹(shù)脂加入Fmoc-Gly-OH(MW297.3)、TBTU或HBTU(MW321)、HOBT(MW153.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑猾@得Fmoc-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(1)的預(yù)處理的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(1)的預(yù)處理的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(3)Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(2)的Fmoc-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤隖moc-Leu-OH(MW353.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，F(xiàn)moc-Leu-OH的重量體積濃度為5～15ml/g；六氫吡啶的DMF溶液中，步驟(2)的Fmoc-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(4)Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(3)的Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Por-OH(MW337.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(3)的Fmoc-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Por-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(5)Fmoc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(4)的Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑猾@得Fmoc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(4)的Fmoc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(6)Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(5)的Fmoc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Asn(Trt)-OH(MW596.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；然后獲得Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(5)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(7)Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(6)的Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑尤隖moc-Gln(Trt)-OH(MW610.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(6)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(8)Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(7)的Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Ile-OH(FW353.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(7)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Ile-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(9)Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(8)的Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH(MW403.4)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF。接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑猾@得Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(8)的樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g；(10)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的制備將步驟(9)的Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂加入六氫吡啶的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(FW585.7)、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，分別用DMF、甲醇、DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；獲得Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂；NMM和DMF中，步驟(9)的樹(shù)脂重量體積濃度為5～15ml/g，F(xiàn)moc-Cys(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～6倍；六氫吡啶的DMF溶液中Fmoc-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Por-Leu-Gly-樹(shù)脂的重量體積濃度為5～15ml/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于，接肽反應(yīng)溫度為15～40℃，時(shí)間為0.5～5小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3所述的方法，其特征在于，脫帽反應(yīng)溫度為15～45℃，時(shí)間為10～60分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于，NMM和DMF中，TBTU或HBTU的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍；，HOBT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的1～6倍，NMM的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～12倍；六氫吡啶的DMF溶液的重量濃度為10～50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其特征在于，NMM和DMF的體積比為NMM∶DMF＝1∶5～15。
7.根據(jù)權(quán)利要求
l所述的方法，其特征在于，加入切肽試劑進(jìn)行切肽包括如下步驟將上述保護(hù)的9肽樹(shù)脂加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，15～35℃反應(yīng)1.5～5小時(shí)，過(guò)濾，濾液加乙醚沉淀，獲得還原型粗品。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征在于，保護(hù)的9肽樹(shù)脂在切肽試劑中的重量體積比為5～20ml/g。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，還原型粗品氧化的方法包括如下步驟將還原型粗品溶于水中，在攪拌下加入0.5～1.5mol/L的氨水、NaOH或KOH，調(diào)節(jié)pH至5.0-10.0，通入空氣、雙氧水氧化或DMSO氧化，過(guò)濾，收集濾液。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于，純化包括如下步驟將權(quán)利要求
9獲得的濾液經(jīng)C18或C8柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac或磷酸緩沖液∶乙腈(9∶1，體積比)；流速為100-650ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用HPLC跟蹤收集所需要的流出液，然后采用常規(guī)的方法凍干，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種固相多肽合成縮宮素(又名催產(chǎn)素)的制備方法，包括如下步驟以Rink Amide樹(shù)脂(包括Rink Amide MBHA樹(shù)脂、RinkAmide AM樹(shù)脂)為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU或HBTU/HOBt為縮合劑，依次逐個(gè)接上氨基酸；然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品，加入堿性物質(zhì)，在pH為7.5－10.0的條件下通空氣氧化或用雙氧水進(jìn)行氧化，獲得氧化型粗品，最后采用C18或C8柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明的方法，生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，環(huán)境污染低，收率高，便于工業(yè)化實(shí)施。
文檔編號(hào)C07K7/00GK1990501SQ200510112356
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月29日
發(fā)明者周逸明 申請(qǐng)人:周逸明, 上海子能制藥有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan