專(zhuān)利名稱(chēng):一種單條線蟲(chóng)dna的快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及線蟲(chóng)DNA的提取，具體涉及一種單條線蟲(chóng)DNA的快速提取方法。
背景技術(shù)：
線蟲(chóng)是動(dòng)物界中數(shù)量最豐富者之一，寄生于動(dòng)、植物，或自有生活于土壤、淡水和海水環(huán)境中。其中松材線蟲(chóng)Bursaphelenchus xylophiIus、椰子紅環(huán)腐線蟲(chóng)漢cocophilus、菊花滑刃線蟲(chóng) Aphelenchoides ri tzemabosi > 馬鈴薯金線蟲(chóng) Globoderarostochiensis等線蟲(chóng)，由于對(duì)農(nóng)業(yè)、林業(yè)等經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)生活都具有嚴(yán)重的危害，易造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是我國(guó)重要的檢疫性線蟲(chóng)。由于線蟲(chóng)體形較小，形態(tài)學(xué)鑒定十分困難，分子生物學(xué)方法已成為十分有效的鑒定手段。線蟲(chóng)的分子生物學(xué)鑒定需要制備用于PCR反應(yīng)的DNA模板，早期方法用SDS破壁結(jié)合氯仿去除蛋白及其他雜質(zhì)，提取線蟲(chóng)DNA。如公開(kāi)號(hào)為CN101580830的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)，就公開(kāi)了裂解液凍融、蛋白酶K消化、氯仿提取等技 術(shù)，但提取時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣，所用試劑多、價(jià)格貴，不利于快速檢測(cè)。所以部分學(xué)者尋求簡(jiǎn)捷的方法包括微型攪拌器破碎法、研磨法、手工切斷法、超聲波勻漿法等，如公開(kāi)號(hào)為CN100487435的發(fā)明專(zhuān)利，就公開(kāi)了線蟲(chóng)用雙蒸水清洗后，直接機(jī)械破碎于檢測(cè)試劑中，通過(guò)濾紙吸附后，95°C加熱，離心，再PCR反應(yīng)和檢測(cè)，該方法雖然快速，操作方便；但該方法需提取與檢測(cè)一起完成，非獨(dú)立快速提取DNA，所以DNA模板無(wú)法備份，且僅對(duì)松樹(shù)萎蔫病原線蟲(chóng)有效，也無(wú)法通用；該方法提取時(shí)樣品損失較大，只是在破碎壓制時(shí)少量吸附于濾紙的DNA和引物進(jìn)行PCR反應(yīng)和檢測(cè)，DNA提取效率低，手工破碎也易造成污染；也未降解蛋白質(zhì)和酶類(lèi)等雜質(zhì)，所以會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。綜上所述，目前還未公開(kāi)一種快速、高效、純度高、污染少、通用的單條線蟲(chóng)DNA的提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種通用、雜質(zhì)少、純度高、污染少、快速、高效、DNA模板備份量較多的單條線蟲(chóng)DNA的快速提取方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種單條線蟲(chóng)DNA的快速提取方法，包括下述步驟
a、線蟲(chóng)洗滌在滅菌的潔凈載玻片上滴加滅菌的雙蒸水，用滅菌的O號(hào)針將單條線蟲(chóng)挑入所述雙蒸水中洗滌；
b、線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移上述單條線蟲(chóng)洗滌后，再將線蟲(chóng)挑入滅菌的200 UL PCR管中，所述PCR管內(nèi)含8 μ L雙蒸水和I yL的10XPCR Buffer溶液，然后13000 rpm離心I min ;10XPCR Buffer 溶液(Mg2+ free):包括 ρΗ8· 3 的 Tris-HCl 溶液 100 mM, KCl 溶液 500mM :購(gòu)于TaKaRa公司；
C、破壞線蟲(chóng)表皮細(xì)胞離心后，將所述PCR管置于液氮中速冷I min，取出后立即在85 °C條件下恒溫2 min，再立即將PCR管的溫度速降至56 °C，恒溫30 sec ;此變溫過(guò)程需在PCR儀中設(shè)置程序，并按照程序操作完成，在冷熱劇烈變化下使線蟲(chóng)體壁細(xì)胞破裂，效果明顯；
d、DNA釋放在上述56°C恒溫后的PCR管中加入濃度為I mg/mL的蛋白酶K(購(gòu)自TaKaRa公司)1 μ L，先在56°C下恒溫15 min，再在95°C條件下恒溫10 min，得到DNA提取液，-20°C保存?zhèn)溆?。蛋白酶K可以消化線蟲(chóng)細(xì)胞，釋放DNA，56°C為其最適作用溫度，95°C為了使蛋白酶K失活以免影響之后的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，效果很好。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一種快速、高效、適用范圍廣的單條線蟲(chóng)DNA提取方法，使用PCR Buffer溶液代替WLB裂解液和SDS裂解液，減少了溶液配置的不確定性和外來(lái)離子的影響；通過(guò)冷熱劇烈變化使線蟲(chóng)體壁細(xì)胞破裂；用蛋白酶K消化線蟲(chóng)細(xì)胞，釋放DNA ;整個(gè)提取過(guò)程在一個(gè)PCR管中完成，并可直接用于PCR擴(kuò)增，沒(méi)有溶液的轉(zhuǎn)移和過(guò)多的溶質(zhì)添加，減少污染及對(duì)后續(xù)PCR的影響；本發(fā)明使用變溫處理代替其他手工破碎方法，不需要操作技巧，減少了外界污染物的摻入，使用液氮處理，縮短了處理時(shí)間；可以對(duì) 單條線蟲(chóng)提取的DNA稀釋32倍進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)，通過(guò)對(duì)16種不同種線蟲(chóng)進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果穩(wěn)定。該方法可通用于對(duì)單條線蟲(chóng)進(jìn)行提取和鑒定，及進(jìn)一步的序列分析。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例I
一種單條松材線蟲(chóng)DNA的快速提取方法，在滅菌的潔凈載玻片上滴加適量滅菌的雙蒸水，用滅菌的O號(hào)針將單條松材線蟲(chóng)挑入雙蒸水中洗滌；該松材線蟲(chóng)洗滌后，再將松材線蟲(chóng)挑入滅菌的200 μ L PCR管中，PCR管內(nèi)預(yù)裝有8 μ L雙蒸水和I yL的10XPCRBuffer溶液(Mg2+ free),然后13000 rpm離心I min ;離心后,將PCR管置于液氮中速冷Imin,取出，立即在85°C條件下恒溫2 min,再將PCR管的溫度速降至56°C,恒溫30 sec ;在上述56°C恒溫后的PCR管中加入濃度為I mg/mL的蛋白酶K溶液I μ L，先在56°C下恒溫15 min，再在95°C條件下恒溫10 min，得到松材線蟲(chóng)DNA提取液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>實(shí)施例2
與實(shí)施例I基本相同，所不同的只是松材線蟲(chóng)由椰子紅環(huán)腐線蟲(chóng)替代，得到的是椰子紅環(huán)腐線蟲(chóng)DNA提取液。
實(shí)施例3
與實(shí)施例I基本相同，所不同的只是松材線蟲(chóng)由馬鈴薯金線蟲(chóng)替代，得到的是馬鈴薯金線蟲(chóng)DNA提取液。
實(shí)施例4
與實(shí)施例I基本相同，所不同的只是松材線蟲(chóng)由菊花滑刃線蟲(chóng)替代，得到的是菊花滑刃線蟲(chóng)DNA提取液。
上述實(shí)施例只是對(duì)本明的說(shuō)明，其它線蟲(chóng)的DNA提取方法同上都可實(shí)現(xiàn)，在此不一一列舉，本明的的方法對(duì)線蟲(chóng)具有通用性，我們共對(duì)16種不同種線蟲(chóng)進(jìn)行DNA提取，都具有雜質(zhì)少、純度高、污染少、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)，并對(duì)各種的DNA提取液32倍稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果都穩(wěn)定，靈敏。
權(quán)利要求
1.一種單條線蟲(chóng)DNA的快速提取方法，其特征在于包括下述步驟a線蟲(chóng)洗滌在滅菌的潔凈載玻片上滴加滅菌的雙蒸水，用滅菌的O號(hào)針將單條線蟲(chóng)挑入所述雙蒸水中洗滌； b線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移上述單條線蟲(chóng)洗滌后，再將線蟲(chóng)挑入滅菌的200 uL PCR管中，所述PCR管內(nèi)含8 μ 雙蒸水和I yL 10XPCR Buffer溶液，然后13000 rpm離心I min，所述10XPCRBuffer 溶液為無(wú) Mg2+ 的 10XPCR Buffer 溶液，其含有 pH8. 3 的 Tris-HCl 溶液 100 mM,KCl 溶液 500 mM ； c破壞線蟲(chóng)表皮細(xì)胞離心后，將所述PCR管置于液氮中速冷I min，取出后立即在85°C條件下恒溫2 min,再立即將PCR管的溫度速降至56°C,恒溫30 sec ； d DNA釋放在上述56°C恒溫后的PCR管中加入I μ L濃度為I mg/mL的蛋白酶K，先在56°C下恒溫15 min，再在95°C條件下恒溫10 min，得到DNA提取液，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>專(zhuān)利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速、高效、適用范圍廣的單條線蟲(chóng)DNA提取方法，使用PCRBuffer溶液代替WLB裂解液和SDS裂解液，減少了溶液配置的不確定性和外來(lái)離子的影響；通過(guò)冷熱劇烈變化使線蟲(chóng)體壁細(xì)胞破裂；用蛋白酶K消化線蟲(chóng)細(xì)胞，釋放DNA；整個(gè)提取過(guò)程在一個(gè)PCR管中完成，并可直接用于PCR擴(kuò)增，沒(méi)有溶液的轉(zhuǎn)移和過(guò)多的溶質(zhì)添加，減少污染及對(duì)后續(xù)PCR的影響；本發(fā)明使用變溫處理代替其他手工破碎方法，不需要操作技巧，減少了外界污染物的摻入，使用液氮處理，縮短了處理時(shí)間；可以對(duì)單條線蟲(chóng)提取的DNA稀釋32倍進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12N15/10GKCN102161989 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 201110049172
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年3月2日
發(fā)明者顧建鋒, 王江嶺, 張建成 申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專(zhuān)利引用 (3),