專利名稱:用裂殖壺菌發(fā)酵生產二十二碳六烯酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產方法，具體涉及利用裂殖壺菌菌株發(fā)酵生產甘油三酯型二十二碳六烯酸。
背景技術：
二十二碳六烯酸(cis-4, 7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid,簡稱 DHA)是歐米嘎3系列長鏈多不飽和脂肪酸，是大腦、視網膜的重要結構物質，還能夠調節(jié)中樞神經系統(tǒng)功能、預防和治療心血管疾病、消除炎癥、抑制癌癥。
DHA的商業(yè)來源目前主要是魚油和微藻。魚油的產量和DHA含量都不穩(wěn)定，提取物夾雜魚腥味，而且從魚油中提取的含DHA混合油脂中還含有二十碳五烯酸(EPA)，據(jù)研究， EPA對嬰幼兒的發(fā)育具有不利的影響。目前的海洋漁業(yè)資源接近枯竭，從魚油中提取DHA造成極大的浪費。微澡的培養(yǎng)需要光照和二氧化碳，生產工藝繁雜，成本較高。隨著人口的增加，以及人們對健康的迫切需求，全世界對DHA的需求量相應增加，需要尋求大量的DHA新來源，而且最好是此來源的DHA不含有EPA。
破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)是一類類似于微藻但缺乏葉綠體故而不行光合作用的專性海生真核微生物，嗜腐敗，廣泛存在于有機溶解物多和鹽度高的環(huán)境中。破囊壺菌科屬管毛生物界(Stramenopila)、不等毛門(Heterokonta)、網粘菌 M (Labyrinthulomycetes)、破囊壺菌目(Thraustochytriales)、裂殖壺菌屬 (Schizochytrium)。
授權公告號為CN 1264967C的專利公開了一種以裂殖壺菌SR21的菌株為出發(fā)菌株，通過化學和物理誘變相結合而得到的一株突變株0UC88，在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，DHA產量達到8. 27g/l，菌體中DHA的百分含量為18-35%。雖然其經誘變獲得的裂殖壺菌菌株在 DHA產量上比之前的研究提高了一倍，但因其所發(fā)明的方法為生產可食用或藥用的產品，其利用誘變得到的菌株存在未知的安全性問題，并且，經誘變得到的菌株，其本質是為發(fā)生了變異的菌株，其具有回復突變的特點，這也使其在工業(yè)化大生產中存在著生產難以穩(wěn)定的缺陷。
公開號為CN 1916156A的專利公開了一種采用松樹花粉垂釣法分離得到的裂殖壺菌(khizochytrium) WZU47711(其保藏編號為CGMCC No. 1730)在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5天，DHA生產率最高為2.76克/(升.天)。雖然其DHA生產較之以前的研究有了較大的提高，但對于進行工業(yè)化大生產，大大降低其生產成本，降低其市場價格，使其在普通消費者中能夠得到大力推廣和普及使用的要求還是遠遠不夠的。
因此，需要尋找一種利用裂殖壺菌(khizochytrium)原始菌株為菌種，經優(yōu)化的生產工藝和或生產培養(yǎng)基配方，能夠大量生產綠色、安全的含高含量甘油三酯型DHA油脂的方法，從而可以達到較大幅度的降低DHA生產成本，進而降低含DHA終端產品價格，降低 DHA的使用門檻，使其在普通大眾消費者中能夠得到大力的推廣和普及使用。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種利用裂殖壺菌(khizochytrium)原始菌株為菌種，工業(yè)化發(fā)酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，該方法能夠低成本、大量生產綠色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。
本發(fā)明提供的技術方案是利用裂殖壺菌(Schizochytrium)工業(yè)化發(fā)酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，包括以裂殖壺菌為菌種，采用具有微量元素的培養(yǎng)基，經發(fā)酵制得二十二碳六烯酸油脂，其中二十碳五烯酸含量在以下；所述具有微量元素的培養(yǎng)基包含碳源、氮源和微量元素，所述微量元素包括生物素、葉綠素、胡蘿卜素、維生素 A、維生素 和維生素B12中的至少一種。
所添加的微量元素為生物素、葉綠素、β-胡蘿卜素、維生素&、維生素 和維生素 B12中的一種或幾種，當為其中一種時，添加量為培養(yǎng)基重量的0. 002-0. 01%;當為其中幾種時，任意一種組分的添加量為培養(yǎng)基重量的0. 002-0. 01 %。
所述菌種為經斜面活化培養(yǎng)、然后轉接入搖瓶擴大培養(yǎng)、再經一級擴大培養(yǎng)得到的裂殖壺菌；或為經斜面活化培養(yǎng)、然后轉接入搖瓶擴大培養(yǎng)、再經一級擴大培養(yǎng)得到得裂殖壺菌和二級擴大培養(yǎng)后得到的裂殖壺菌。
在發(fā)酵培養(yǎng)40_60h時添加發(fā)酵液體積0. 1-0. 3%的檸檬酸。
在發(fā)酵培養(yǎng)60_80h時，添加發(fā)酵液體積0. 1-1. 0%的乙醇。
上述碳源包括葡萄糖、糖蜜、玉米糖漿或其他用于發(fā)酵的常規(guī)碳源中的至少一種； 氮源包括大豆粉、植物蛋白水解物、玉米漿、谷氨酸鈉、酵母提取物、谷氨酸、蛋白胨、硝酸鈉、硫酸銨和硝酸銨等中的一種或多種；
所述具有微量元素的培養(yǎng)基還包含無機鹽。無機鹽包括氯化鈉、氯化鎂、海鹽、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和磷酸鈉等中的一種或多種。
本發(fā)明可在整個發(fā)酵過程中通入空氣，空氣通氣量為1 0. 2至1 0.8VVM;發(fā)酵初始PH控制在6. 5-7. 5，發(fā)酵40h-60h時添加檸檬酸使發(fā)酵液pH維持在6. 8-7. 0 ；在發(fā)酵過程中通過補充碳源將培養(yǎng)基中的還原糖控制在4. 0-5.0% (w/w)；在發(fā)酵進入穩(wěn)定期 (本發(fā)明所用菌種進入穩(wěn)定期的時間為40-45h)前控制溫度為^-30°C，在進入穩(wěn)定期后控制溫度為M_26°C。
本發(fā)明上述補充碳源最好在培養(yǎng)基中還原糖為3-3. 5% (w/w)時進行。
本發(fā)明發(fā)酵結束后可通過離心、過濾或絮凝的方法分離得到菌體，然后將菌體通過擠壓或酶解法破壁后利用非極性溶劑回收含二十二碳六烯酸的粗油，并通過精煉得到二十二碳六烯酸油脂。
上述非極性溶劑為正己烷。
本發(fā)明制得的二十二碳六烯酸油脂不需要進一步的化學改性即可直接用于為需要DHA的人群，包括嬰幼兒、孕婦或哺乳期婦女，或是表現(xiàn)出DHA不足性疾病的人提供補充 DHA。本發(fā)明的優(yōu)點在于DHA產量高，DHA純度高，質量安全可靠，生產成本低，生產穩(wěn)定，并且基本不含EPA ；能夠低成本、大量生產綠色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。
具體實施方式
本發(fā)明通過優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件采用傳統(tǒng)的發(fā)酵方法生產二十二碳六烯酸油脂，優(yōu)化的培養(yǎng)基配方見下表
表優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方(以克/IOOml培養(yǎng)基計)
項目含量項目含量初始葡萄糖3-5味精0. 8-2酵母膏0. 8-1. 5海鹽0. 8-1. 5硫酸鈉0. 05-0. 1七水硫酸鎂0. 2-0. 6磷酸氫二鉀0. 2-0. 6谷氨酸0. 1-0. 4玉米漿0. 1-0. g生物素0-0. 01葉綠素0-0.01貝塔胡蘿卜素0-0. 01VB10-0.01VB60-0. 01VB120-0.01pH5. 5-6. 5
斜面菌種經搖瓶及種子罐擴大培養(yǎng)后按照1-10%的接種量接入發(fā)酵罐中，初始PH在6. 5-7. 5，控制罐溫28-30°C，菌體生長進入穩(wěn)定期控制溫度為24- °C。罐壓 0.03kpa，不進行機械攪拌，通氣量控制在1 0.2-1 0. 8VVM，發(fā)酵過程中控制還原糖為 4. 0-5.0%，當還原糖低于3. 5%時即補充滅菌的濃度為40-60%的葡萄糖，在發(fā)酵40-60h 時添加0. 1-0. 3 %的檸檬酸，將發(fā)酵液pH控制在6. 8-7. 0，發(fā)酵90-·，在還原糖降低到 3.0%，氨基氮濃度為0. 037%以下放罐。
由此發(fā)酵工藝生產DHA，干菌體中含油量為60-80 %，油脂中DHA含量為50-55 %， 而且其中EPA含量不超過1. 0%，DHA生產率達到4. 86克/ (升.天)，比已見報道菌株生產率高出約1倍。
在本發(fā)明方法中，在適合于生產含DHA油的條件下培養(yǎng)裂殖壺菌。一般，真菌培養(yǎng)技術是本領域技術人員所熟知的，這些技術可以用于本發(fā)明方法。通常采用斜面菌種接種搖瓶，搖瓶接種一級種子罐，一級種子罐接種二級種子罐，二級種子罐接種發(fā)酵罐的工藝流程進行發(fā)酵培養(yǎng)裂殖壺菌生產含甘油三酯型DHA的混合油脂。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可以不相同，但都含有碳源和氮源。較好的碳源是葡萄糖，其含量為每升培養(yǎng)基中約80-150克。用量可以隨最終培養(yǎng)物密度而不同?？梢允褂玫奶荚窗ㄆ咸烟?，糖蜜，玉米糖漿或其他用于發(fā)酵的低成本常規(guī)碳源。本領域熟練技術人員很容易確定這些碳源的合適用量。通常，在培養(yǎng)過程中需要分批另外補充碳源，以滿足微生物對碳源的消耗，而一次性加入全部碳源則會抑制微生物的生長。
氮源通常選擇有機和無機氮源。有機氮源通?？梢赃x用的有大豆粉、植物蛋白水解物、玉米漿、酵母提取物和蛋白胨。無機氮源通?？梢赃x用的有硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨等。有機氮源作為長效氮源使用，而無機氮源作為速效氮源使用，通常情況下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇有機和無機氮源配合使用，較好的是使用酵母提取物和硝酸氨的配合，其用量一般為碳源的六-十分之一。本領域熟練技術人員很容易確定這些氮源的添加量。氮源可以分批加入，也可以在配制培養(yǎng)基時一次性加入。
本發(fā)明在培養(yǎng)基中強化添加特定微量元素，不僅可以促進菌體的生長，而且在含量產率的提高方面具有明顯的效果?？梢赃x用的微量元素有生物素、葉綠素、胡蘿卜素、 維生素B1、維生素 和維生素Β12。較好的是在培養(yǎng)基中添加0.01%的生物素、0.01%的葉綠素、0.01%的維生素B1和0.01%的維生素B12。
通常，按照需要的碳源和氮源的添加量在普通發(fā)酵罐中配制培養(yǎng)基。例如，可以按照每升自配海水中添加50克葡萄糖、10克酵母提取物、1克硫酸鈉、0. 1克的生物素、0. 1克的葉綠素、0. 1克的VB1和0. 1克的VB12以及其他鹽類來配制發(fā)酵用培養(yǎng)基。如前所述，可以使用其他碳源和氮源及其混合物。
將配制好的培養(yǎng)基經高溫滅菌(121°C，30min，0. 1-0. 12Mpa)，并冷卻至約30°C后接入培養(yǎng)好的裂殖壺菌菌種進行培養(yǎng)。在發(fā)酵液中通以空氣進行氣體交換，供給菌體生長所需要的氧氣，并達到攪拌的效果。通氣量據(jù)不同發(fā)酵階段可不相同，以1 0.5VVM為宜。
接種量以2%至10%為好，最好使用約10%體積的接種量。
發(fā)酵過程中需要監(jiān)測營養(yǎng)物消耗水平。當發(fā)酵液中還原糖水平下降至低于3. 5% 時，應補充葡萄糖。在一個優(yōu)選的實施例中，一個發(fā)酵周期消耗每升培養(yǎng)基100克葡萄糖和 15克酵母提取物。
發(fā)酵溫度一般控制在M至30°C。在發(fā)酵的不同階段可以控制不同的溫度，一般在發(fā)酵的初始階段控制在稍高的溫度，較好的是控制在^_30°C，以利于菌體的生長和繁殖， 而在油脂積累的階段將溫度控制在誘導DHA優(yōu)先產生積累的值，優(yōu)選的是控制在M-26°C。
在發(fā)酵的不同階段建議控制不同的pH值發(fā)酵開始將pH調節(jié)至6. 5-7. 5，隨著培養(yǎng)過程的進行，當菌體生長進入穩(wěn)定期，添加發(fā)酵液體積0. 1-0. 3 %的檸檬酸，并將發(fā)酵液 PH控制在6. 8-7. 0，意外發(fā)現(xiàn)，添加檸檬酸而非其他物質以調節(jié)發(fā)酵液的pH，其最終發(fā)酵液中的DHA含量和油脂產量都可以達到更高的水平。
在發(fā)酵過程中，維持培養(yǎng)基中的高溶氧濃度，能夠緩解高營養(yǎng)物濃度引起的生長抑制和/或提高油脂中的DHA殘基的相對濃度。溶氧濃度通常情況下可以通過提高罐壓，和進行機械攪拌來達到，本發(fā)明發(fā)酵過程采用無攪拌方式發(fā)酵，在發(fā)酵的后期添加0. 1-1. 0% (ν/ν)的乙醇來增加溶氧量，獲得了較好的效果。在此條件下進行發(fā)酵，可以提高碳的利用率，從而得到較高的生物量和DHA產量，同時節(jié)約了能耗，降低了生產成本。
進行一項或多項的改進，可以發(fā)酵得到含有高于50% DHA殘基的甘油三酯類油脂，最佳條件下可以得到含有高于55%的DHA殘基的甘油三酯類油脂。
在最佳的實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度約80g/l，酵母抽提物濃度約 15g/l，硝酸鈉濃度約10g/l，強化微量元素(添加0. 01 %的生物素、0. 01 %的葉綠素、 0. 01 %的VB1和0. 01 %的VB12)，在發(fā)酵過程中少量多次補充共計60g/l的葡萄糖，通氣量為0. 5VVM。當菌體生長進入穩(wěn)定期，添加發(fā)酵液體積0. 1-0. 3%的檸檬酸，并將發(fā)酵液pH 控制在6. 8-7. 0。在發(fā)酵60h-80h，菌體生長進入發(fā)酵后期，通過添加0. 5%的乙醇來增加溶氧量。當還原糖濃度下降至3.0%，氨基氮含量不得超過0. 037 %時結束發(fā)酵，能夠獲得 DHA含量為55%的混合油脂，并且其中的EPA含量不超過0. 5%。[0039]通過以上發(fā)酵過程優(yōu)化，能夠獲得較高的生物量，其中含有60%至80%的油脂， 其中甘油三酯形式的DHA殘基占50%至55%，并且其中的EPA含量小于1%，更加優(yōu)選的方式下EPA含量低于0. 5%。
可以通過各種方法收獲菌體，例如離心、絮凝、過濾等。較好的處理菌體的方式是將收集到的菌體利用噴霧干燥的方法，獲得干燥的菌體。其中可以對發(fā)酵液進行預處理，加入酒精沉淀其中的蛋白質和糖，酒精添加量為1 1-3。
對發(fā)酵得到的菌體可以通過機械擠壓(例如均質)的方式進行破壁處理，也可以通過酶解的方法進行破壁，其中酶法破壁可以優(yōu)選復合酶(酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶二種或幾種的復合)，添加量為發(fā)酵液的0.01-1%。
用非極性溶劑進行萃取，以獲得含DHA殘基的甘油三酯形式的混合油脂。非極性溶劑優(yōu)選正己烷。通過萃取得到含甘油三酯型的DHA粗油。粗油可以進一步通過常規(guī)精煉的方法得到精油。
本發(fā)明的最佳應用是給嬰幼兒提供一種優(yōu)質安全的甘油三酯型的DHA源，使得嬰幼兒食品中的DHA含量接近母乳中的DHA含量。
除了用作嬰幼兒配方食品外，此種來源的DHA也可以用于給孕婦或哺乳期婦女， 以及患有DHA缺乏導致的神經障礙的人經腸或不經腸補充DHA。
以上對本發(fā)明進行了全面的描述，以下非限定性實施例用于進一步說明本發(fā)明。
實施例1.強化微量元素的培養(yǎng)基配方對DHA含量和產率的影響
培養(yǎng)基配方a (g/100ml培養(yǎng)基)
權利要求
1.用裂殖壺菌(Schizochytrium)發(fā)酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，包括以裂殖壺菌khizochytrium sp. ATCC20888為菌種，采用具有微量元素的培養(yǎng)基，經發(fā)酵制得二十二碳六烯酸油脂，其中二十碳五烯酸含量在以下；所述每IOOml具有微量元素的培養(yǎng)基含有3g葡萄糖、0. Sg味精、0. Sg酵母膏、0. Sg海鹽、0. 05g硫酸鈉、0. 2g七水硫酸鎂、 0. 2g磷酸氫二鉀、0. Ig谷氨酸、0. Ig玉米漿、0. Olg生物素、0. Olg VB12,0.01g卯6和余量的水，pH6. 5-7. 5 ；或者每IOOml具有微量元素的培養(yǎng)基含有4. 5g葡萄糖、0. 9g味精、1. Og酵母膏、0. 9g海鹽、0. Ig硫酸鈉、0. 2g七水硫酸鎂、0. 2g磷酸氫二鉀、0. Ig谷氨酸、0. Ig玉米漿、0. Olg生物素、0. Olg VB12,0.01g 和余量的水，pH6. 5-7. 5 或者IOOml具有微量元素的培養(yǎng)基含有5g葡萄糖、1. 4g味精、1. Og酵母膏、1. Ig海鹽、0. Ig硫酸鈉、0. 2g七水硫酸鎂、0. 5g磷酸氫二鉀、0. 3g谷氨酸、0. 3g玉米漿、0. Olg生物素、0. Olg葉綠素、0. Olg貝塔胡蘿卜素、0. Olg VB1^O. Olg VB12、0. Olg VB6 和余量的水，pH6. 5-7. 5。
2.用裂殖壺菌(khizochytrium)發(fā)酵生產二十二碳六烯酸油脂的方法，包括以裂殖壺菌khizochytrium limacinum ATCC MYA-1381為菌種，采用具有微量元素的培養(yǎng)基，經發(fā)酵制得二十二碳六烯酸油脂，其中二十碳五烯酸含量在以下；所述每IOOml具有微量元素的培養(yǎng)基含有3g葡萄糖、0. 8g味精、0. 8g酵母膏、0. 8g海鹽、0. 05g硫酸鈉、0. 2g七水硫酸鎂、0. 2g磷酸氫二鉀、0. Ig谷氨酸、0. Ig玉米漿、0. Olg生物素、0. Olg VB12、0· Olg VB6 和余量的水，pH6. 5-7.5。
3.根據(jù)權利要求
1所述的方法，其特征在于所述菌種為經斜面活化培養(yǎng)、然后轉接入搖瓶擴大培養(yǎng)、再經一級擴大培養(yǎng)得到的裂殖壺菌；或為經斜面活化培養(yǎng)、然后轉接入搖瓶擴大培養(yǎng)、再經一級擴大培養(yǎng)和二級擴大培養(yǎng)后得到的裂殖壺菌。
4.根據(jù)權利要求
2所述的方法，其特征在于所述菌種為經斜面活化培養(yǎng)、然后轉接入搖瓶擴大培養(yǎng)、再經一級擴大培養(yǎng)得到的裂殖壺菌；或為經斜面活化培養(yǎng)、然后轉接入搖瓶擴大培養(yǎng)、再經一級擴大培養(yǎng)和二級擴大培養(yǎng)后得到的裂殖壺菌。
5.根據(jù)權利要求
1或2或3或4所述的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)40-60h時添加發(fā)酵液體積0. 1-0. 3%的檸檬酸。
6.根據(jù)權利要求
1或2或3或4所述的方法，其特征在于在發(fā)酵培養(yǎng)60-80h時，添加發(fā)酵液體積0.1-1. 0%的乙醇。
7.根據(jù)權利要求
1或2或3或4所述的方法，其特征在于在發(fā)酵過程中通入空氣，空氣通氣量為1 0. 2至1 0. 8VVM;發(fā)酵初始PH控制在6. 5-7. 5，發(fā)酵40h-60h時添加檸檬酸使發(fā)酵液PH維持在6. 8-7. 0 ；在發(fā)酵過程中通過補充碳源將培養(yǎng)基中的還原糖濃度控制在4. 0-5. Owt % ；在發(fā)酵進入穩(wěn)定期前控制溫度為^_30°C，在進入穩(wěn)定期后控制溫度為 24H
8.根據(jù)權利要求
7所述的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中還原糖濃度在3-3.5wt%時補充碳源。
9.根據(jù)權利要求
7所述的方法，其特征在于發(fā)酵結束后通過離心、過濾或絮凝的方法分離得到菌體，然后將菌體通過擠壓或酶解法破壁后利用非極性溶劑回收含二十二碳六烯酸的粗油，并通過精煉得到二十二碳六烯酸油脂。
專利摘要
利用裂殖壺菌(Schizochytrium)工業(yè)化發(fā)酵生產含甘油三酯型二十二碳六烯酸油脂的方法，包括以裂殖壺菌為菌種，采用具有微量元素的培養(yǎng)基，經發(fā)酵制得二十二碳六烯酸油脂；所述具有微量元素的培養(yǎng)基包含碳源、氮源、無機鹽和微量元素，所述微量元素包括生物素、葉綠素、β-胡蘿卜素、維生素B1、維生素B6和維生素B12中的至少一種。本發(fā)明制得的二十二碳六烯酸油脂不需要進一步的化學改性即可直接用于為需要DHA的人群，包括嬰幼兒、孕婦或哺乳期婦女，或是表現(xiàn)出DHA不足性疾病的人提供補充DHA。本發(fā)明DHA產量高、純度高，質量安全可靠，生產成本低，生產穩(wěn)定，并且基本不含EPA；能夠低成本、大量生產綠色、安全的高含量的甘油三酯型DHA油脂。
文檔編號C12P7/64GKCN101519676 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200910061419
公開日2011年9月14日 申請日期2009年4月3日
發(fā)明者吳艷榮, 夏德才, 徐從英, 林紹朗, 解秀娟 申請人:湖北福星生物科技有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),