專利名稱:噴墨基因打印的制作方法
噴墨基因打印
相關(guān)申請
本申請要求保護(hù)2007年6月7日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號60/942，549的權(quán)益，其公開內(nèi)容以其全文引用的形式合并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及目的化合物至活細(xì)胞內(nèi)的遞送。
發(fā)明背景
在組織工程的跨學(xué)科領(lǐng)域中，通過利用活細(xì)胞作為工程材料，有效的新型療法正被開發(fā)來治療人健康的結(jié)構(gòu)和功能障礙。參見可在nsf.gov上獲得的Viola等人,2003年10月14日為國家自然科學(xué)基金會(huì)準(zhǔn)備的"TheEmergence of Tissue Engineering as aResearch Field,"。在一些組織工程領(lǐng)域內(nèi)，研究者正在通過細(xì)胞的組合產(chǎn)生二維和三維組織和器官以修復(fù)或取代患病或受損組織。
在其中正常組織不能用可獲得的細(xì)胞進(jìn)行工程，或需要增強(qiáng)的細(xì)胞功能的情況下，備選方法例如生長因子補(bǔ)充給藥法、大分子治療或基因修飾可以是獲得期望的功能性所必需的。此外，在組織工程中，為了促進(jìn)功能性組織和器官的形成，基因、蛋白質(zhì)、分子、納米顆粒、藥物等的轉(zhuǎn)染或遞送日益變得至關(guān)重要。
基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已在不同的研究領(lǐng)域用以改善細(xì)胞和組織功能。雖然在本領(lǐng)域內(nèi)存在用于將基因遞送入細(xì)胞的已建立的方法，但現(xiàn)有技術(shù)在組織工程中的應(yīng)用不太理想。基因轉(zhuǎn)染的重要目的是獲得至靶細(xì)胞群體的有效率基因遞送，同時(shí)保持細(xì)胞成活力。目前，用于基因轉(zhuǎn)染的最廣泛使用的 方法是病毒轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔和基因槍。
使用病毒載體的轉(zhuǎn)染是其中將待遞送的核酸插入病毒的技術(shù)。在病毒載體通過?？?docking)機(jī)制進(jìn)入被靶向的細(xì)胞后，核酸被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核。雖然病毒轉(zhuǎn)染具有高效率，但其也具有許多缺點(diǎn)，例如殘留的病原性以及在插入誘變后瘤生長(neoplastic growth)的潛在誘導(dǎo)。這些擔(dān)憂已限制了其在藥物和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別地臨床基因治療中的應(yīng)用。
顯微注射是另一種可采用的技術(shù)?？墒褂蔑@微注射針頭將遺傳物質(zhì)直接注射入培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞核。其在將特定遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中是非常有效的，并且已廣泛地用于干細(xì)胞核移植應(yīng)用中。然而，其效率不高并且不適合需要轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞的研究和應(yīng)用。
電穿孔，受控電場用于幫助細(xì)胞透化的應(yīng)用，也用于增強(qiáng)基因至細(xì)胞內(nèi)的吸收。進(jìn)入的機(jī)制基于電脈沖對細(xì)胞膜進(jìn)行的擾動(dòng)，該擾動(dòng)形成了允許DNA通過的小孔。該技術(shù)需要針對所使用的各類型細(xì)胞就脈沖的持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度進(jìn)行最優(yōu)化，以及需要允許有效遞送和殺死細(xì)胞之間的臨界平衡。低細(xì)胞成活力是通過電穿孔進(jìn)行的轉(zhuǎn)染的主要限制。
最后，基因槍可通過將用DNA包被的金顆粒射向細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)將基因直接遞送入組織或細(xì)胞。該技術(shù)允許直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和甚至細(xì)胞核，從而避開了細(xì)胞的內(nèi)體區(qū)室。然而，該方法受限于低轉(zhuǎn)染率。
因此，存在對用核酸、蛋白質(zhì)、分子、納米顆粒藥物等有效且有效率地轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時(shí)保護(hù)它們的成活力的新方法的需要。也存在對將轉(zhuǎn)染與細(xì)胞遞送組合，以及進(jìn)一步將此類技術(shù)組合入一個(gè)平臺(tái)或裝置從而在組織工程應(yīng)用中進(jìn)行有效且有效率的轉(zhuǎn)染的需要。
發(fā)明概述
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了用目的化合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，包括:1)在液體載體中提供包含目的化合物和細(xì)胞的組合物；和2)迫使所述組合物通過噴嘴，以便在目的化合物存在的情況下對細(xì)胞施加應(yīng)力。在一些實(shí)施方案中，至少1%的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染(例如，通過計(jì)數(shù)，將活轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)目與活細(xì)胞(轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的)的總數(shù)相比較)。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行迫使步驟I至100微秒的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞，目的化合物選自:核酸、蛋白質(zhì)、分子、納米顆粒和藥物。在另外的實(shí)施方案中，通過用噴墨打印裝置噴墨打印細(xì)胞來進(jìn)行迫使步驟。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了打印細(xì)胞的方法，其中至少一部分細(xì)胞被目的化合物轉(zhuǎn)染，包括步驟:1)提供包括至少一個(gè)噴墨打印機(jī)墨盒的噴墨打印裝置；2)將待打印的組合物裝載入打印機(jī)墨盒，以便組合物在裝載后在目的化合物存在的情況下包含細(xì)胞；和3)將所述裝載的組合物打印至基質(zhì)上。在一些實(shí)施方案中，例如用瓊脂或膠原包被基質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，將組合物在體內(nèi)打印至組織基質(zhì)上。優(yōu)選，至少1%的活打印細(xì)胞被轉(zhuǎn)染(例如，通過計(jì)數(shù)，將活轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)目與活細(xì)胞(轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的)的總數(shù)相比較)，和至少25%的打印細(xì)胞在打印后是活的(通過將打印前活細(xì)胞的總數(shù)與打印后活細(xì)胞的總數(shù)相比較)?？杀淮蛴〉募?xì)胞包括真核細(xì)胞和原核細(xì)胞，目的化合物包括核酸、蛋白質(zhì)、分子、納米顆粒和藥物。
本發(fā)明的其他方面是形成活細(xì)胞的陣列的方法，包括:1)提供包含至少一個(gè)噴墨打印機(jī)墨盒的裝置；2)將組合物裝載入打印機(jī)墨盒，以便組合物在至少一種目的化合物存在的情況下包含細(xì)胞；和3)將組合物以有組織的模式打印在基質(zhì)上。在一些實(shí)施方案中，用例如瓊脂或膠原包被基質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，組合物被在體內(nèi)打印至組織基質(zhì)上。優(yōu)選至少I %的活打印細(xì)胞被轉(zhuǎn)染(例如，通過計(jì)數(shù)，將活轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)目與活細(xì)胞(轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的)的總數(shù)相比較)，并且至少25%的打印細(xì)胞在所述打印步驟后是活的(通過將打印前活細(xì)胞的總數(shù)與打印后活細(xì)胞的總數(shù)相比較)?？杀淮蛴〉募?xì)胞包括真核細(xì)胞和原核細(xì)胞，目的化合物包括核酸、蛋白質(zhì)、分子、納米顆粒和藥物。
還提供了用于打印細(xì)胞的設(shè)備，其包括具有至少一個(gè)噴墨打印機(jī)墨盒和待打印的被裝載入打印機(jī)墨盒的組合物，所述組合物在至少一種目的化合物存在的情況下包含細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是如本文所述的方法用于制備組合物或藥劑的用途，所述組合物或藥劑用于治療或用于進(jìn)行如本文所述的治療方法，或用于制造如本文所述的制品。
附圖概述

圖1.通過共打印進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)染的潛在機(jī)制的示意圖。當(dāng)細(xì)胞和質(zhì)粒載體在打印過程中通過打印頭的墨水通道時(shí)，噴口噴射時(shí)產(chǎn)生的高切應(yīng)力和熱可引起細(xì)胞膜的短暫微小破壞(micro-disruption),從能允許質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
圖2.通過 使用改進(jìn)的商業(yè)噴墨打印機(jī)共打印進(jìn)行的使用pmaxGFP質(zhì)粒的細(xì)胞的體外噴墨轉(zhuǎn)染。(a)-(c)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)。PAEC細(xì)胞在打印后第2天在膠原凝膠上展示正常的形態(tài)學(xué)(a)。在GFP熒光顯微鏡下，在這些打印細(xì)胞當(dāng)中看到GFP表達(dá)(b)。利用DAPI和GFP熒光顯微鏡可看到打印細(xì)胞的細(xì)胞核(較淺的點(diǎn))和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因表達(dá)(更亮的點(diǎn))(C)。(d)-(e)噴墨轉(zhuǎn)染法與基于脂質(zhì)體的方法和電穿孔法的比較。與脂質(zhì)體化學(xué)試劑(Lipofectamine 2000試劑)或電穿孔(Nucleofection)法相比較，噴黑轉(zhuǎn)染法在轉(zhuǎn)染后具有更高的細(xì)胞成活力(d)。噴墨法的總轉(zhuǎn)染效率比Nucleofection法的低，但比Lipofectamine 試劑法的高(e)。(f)-(h)打印參數(shù)和條件對基因轉(zhuǎn)染的影響。更高濃度的質(zhì)粒展示更高的轉(zhuǎn)染效率(f)。HP 51629a(" HP 29")噴黑墨盒(更小的噴口直徑)展示比HP 51626a(" HP 26")墨盒(更大的噴口直徑)更高的基因表達(dá)(g)。與含有IacZ和GFP-VEGF的更大的pIRES質(zhì)粒相比較，更小的pmaxGFP 質(zhì)粒展示更高的轉(zhuǎn)染效率。
圖3.用pma xGFP 質(zhì)粒打印的細(xì)胞組(HP695C打印機(jī))在第I天的熒光顯微鏡和相差顯微鏡圖像。在對照組中，手工操作細(xì)胞和質(zhì)粒的混合物。
圖4.用pmaxGFP 質(zhì)粒打印的兩組細(xì)胞(HP550C打印機(jī))在第2天的熒光顯微鏡和相差顯微鏡圖像。在對照組中，手工操作細(xì)胞和質(zhì)粒的混合物。
圖5.用pmaxGFP 質(zhì)粒打印的兩組細(xì)胞(HP550C打印機(jī))在第4天的熒光顯微鏡和相差顯微鏡圖像。在對照組中，手工操作細(xì)胞和質(zhì)粒的混合物。
圖6.用GPF和VEGF打印的兩組細(xì)胞(HP550C打印機(jī))在第2天的熒光顯微鏡和相差顯微鏡的圖像。在對照組中，手工操作細(xì)胞和質(zhì)粒的混合物。
圖7.原位直接打印(direct printing)和體內(nèi)噴墨基因轉(zhuǎn)染。(a)在I周的植入后從裸小鼠的皮下組織取回植入片。在小鼠的皮下組織中看到原位裝配的血纖蛋白層，并且在血纖蛋白層中發(fā)現(xiàn)血管系統(tǒng)。(b)取回的血纖蛋白層在培養(yǎng)皿中的總體檢查。血纖蛋白凝膠展示矩形形狀，其與預(yù)先設(shè)計(jì)的用于原位直接打印的模式相匹配。(c)-(d)血纖蛋白層內(nèi)的細(xì)胞的熒光顯微鏡檢查。不僅可以看到被DAPI染成藍(lán)色的血纖蛋白層內(nèi)的細(xì)胞的細(xì)胞核(更淺的點(diǎn))，而且還在血纖蛋白層內(nèi)捕獲的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GFP表達(dá)(更亮的點(diǎn))(C)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞還顯現(xiàn)紅色熒光(圖(d)中更亮的點(diǎn))，這表明轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是來自體內(nèi)定噴墨打印的移植細(xì)胞(d)。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
本發(fā)明涉及將目的化合物轉(zhuǎn)染入活細(xì)胞的方法。所有引用的美國專利參考資料的公開內(nèi)容通過以達(dá)到它們與本文的公開內(nèi)容一致的程度引用的方式合并入本文。
如本發(fā)明的說明書和所附權(quán)利要求
中所使用的，除非上下文清楚地指出，否則單數(shù)形式“a”、“an”或“the”旨在也包括復(fù)數(shù)形式。此外，如本文所使用的，術(shù)語“大約”和“大致”當(dāng)指可測量的值例如化合物的量、劑量、時(shí)間、溫度等，其表示包括指定量的20%、10%、5%U%>0.5%或甚至0.1 %的變化。同樣，如本文所使用的，“和/或”是指和包括一個(gè)或更多個(gè)關(guān)聯(lián)列出的項(xiàng)的任何和任何可能的組合，以及當(dāng)在二選一(“或”)的情況下解釋時(shí)，不包括組合。
如本文所使用的，“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”是指目的化合物至細(xì)胞內(nèi)的遞送。例如，術(shù)語“轉(zhuǎn)染”在本文中用于針對真核和原核細(xì)胞?！澳康幕衔铩卑ǖ幌抻诎怂?例如，基因、質(zhì)粒、siRNA等)的化合物、蛋白質(zhì)、小分子、納米顆粒(即，至少一維小于200nm的微小顆粒)、藥物或有待遞送入活細(xì)胞的其他化合物。在一些實(shí)施方案中，目的化合物包含在組合物中，所述組合物還包含待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。組合物中目的化合物的理想濃度可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。根據(jù)一些實(shí)施方案使用的組合物中目的化合物濃度包括但不限于0.01至50 μ g/μ L,0.05 至 10、15 或 20 μ g/μ L、0.1 至 5yg/yL、0.1 至 2.0 μ g/μ L，和 I 至 2 μ g/μ L 的組合物。細(xì)胞的理想濃度也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，通過考慮不同細(xì)胞類型的相對大小來確定。根據(jù)一些實(shí)施方案的組合物中細(xì)胞的濃度包括但不限于大約ΙΟ5、ΙΟ6、107、IO8或IO9個(gè)細(xì)胞/mL。
在一些實(shí)施方案中，在載體(即，用于遞送的媒介物)中提供目的化合物?？墒褂萌魏芜m當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于，核酸載體、基于脂質(zhì)體(例如，陽離子脂質(zhì))的載體，例如季銨去污劑、膽固醇和二?；视偷年栯x子衍生物，和多胺的脂質(zhì)衍生物；基于肽的載體，例如Cys-Trp-Lys等；聚合物介導(dǎo)的載體,例如聚乙烯亞胺(PEI)、生物可降解的聚合物(例如，聚[a-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸])、熱敏聚合物(例如，聚(N-異丙烯酰胺(IPAAm)-共-2-( 二甲氨基)乙基異丁烯酸酯(DMAEMA)-共聚-甲基丙烯酸丁酯(BMA))、PEG-聚(D，L乳酸-共聚-乙醇))；二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖；磷酸鈣；活化的樹枝狀大分子(activatedDendrimer);非脂質(zhì)體的脂質(zhì)；和功能性納米顆粒，例如量子點(diǎn)納米顆粒、金納米顆粒、娃納米顆粒、磁納米顆粒、脂質(zhì)納米顆粒、聚陽離子納米顆粒、聚合物納米顆粒等。
常用核酸載體的實(shí)例包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、DNA病毒、RNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，已知其全都用于在細(xì)胞中表達(dá)異源核酸。參見例如美國專利6，392，118、6，309, 883,6, 258，354和4，959，313。載體應(yīng)當(dāng)包含與核酸有效連接以在細(xì)胞中表達(dá)一個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子(例如，SV40啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR-啟動(dòng)子或細(xì)胞巨化病毒CMV)啟動(dòng)子)?？筛鶕?jù)一些實(shí)施方案使用的質(zhì)粒的實(shí)例包括但不限于pmaXGFPTM(AmaXaBiosystems, Gaithersburg, Maryland)、pIRES-VEGF-GFP(BD Biosciences, Bedford, MA)、pIRES-lacZ(BCCM/LMBP, Belgium)和 pMACSKKII_PDX(Miltenyi Biotec， Germany)。在一些實(shí)施方案中，編碼區(qū)包括報(bào)告基因例如綠色熒光蛋白(GFP)和/或功能性蛋白例如生長因子(例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF))或分化因子。參見例如美國專利申請公開號2007/0031384，通過以引用的方式合并入本文。還可以以裸露的或以與陽離子脂質(zhì)復(fù)合的形式提供核酸。參見，例如，美國專利號5，676，954,5, 589，466,5, 693，622,5, 580，859、5，703，055 和 6，413，942。
取決于所選擇的特定的系統(tǒng)，核酸的表達(dá)可以是穩(wěn)定表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)。就術(shù)語核酸編碼序列的“表達(dá)”或“表現(xiàn)(expression)”而言，其意指序列被轉(zhuǎn)錄和任選地翻譯。通常，根據(jù)本發(fā)明，編碼區(qū)的表達(dá)將導(dǎo)致產(chǎn)生編碼多肽。
在一些實(shí)施方案中可以在液體載體中提供目的化合物。液體載體的實(shí)例包括但不限于水、水溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS))、轉(zhuǎn)染溶例如Nucleofector 溶液(AmaxaBiosystems, Gaithersburg, Maryland)等等，并且必要時(shí)可包含額外的成分。
可在目的化合物“存在的情況下”提供細(xì)胞。如本文所使用的，當(dāng)在相同的組合物中包含細(xì)胞和目的組合物時(shí)，細(xì)胞在目的化合物“存在的情況下”存在，并且目的化合物在物理上存在于細(xì)胞外面，但能夠在例如轉(zhuǎn)染前通過擴(kuò)散或其他方式與細(xì)胞相互作用。在目的化合物存在的情況下的細(xì)胞在使用本文公開的方法轉(zhuǎn)染之前，可以在之前已用相同的或不同的目的化合物進(jìn)行了轉(zhuǎn)染或之前可以未進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施方案中，可預(yù)先混合化合物和/或組合物以形成包含目的化合物和細(xì)胞的組合物。在其他實(shí)施方案中，可在即將轉(zhuǎn)染前向含有細(xì)胞的組合物中加入目的化合物來形成包含目的化合物和細(xì)胞的組合物。
如本文所使用的， “細(xì)胞”可以是任何類型的真核或原核細(xì)胞而無任何限制。哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括小鼠、大鼠、狗、獵、猴子和人細(xì)胞)在一些實(shí)施方案中例如對于組織工程應(yīng)用是優(yōu)選。在其中將通過本文中的方法產(chǎn)生的組織植入受試者的應(yīng)用中，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是與其中將植入所述組織的受試者相同的物種的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞包括為自體的(即，來自待治療的受試者的)、等基因的(isogeneic)(即，遺傳上相同但受試者不同，例如來自相同的雙胞胎)、同種異體的(即，來自相同物種的遺傳上不同的成員)或異種的(即，來自不同種的成員)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，真核細(xì)胞可獲自供體(活的或尸體的)或來自已建立的細(xì)胞系。為了從供體(例如，生物支架移植物的潛在受者)獲得細(xì)胞，可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)活檢技術(shù)(biopsy technique)。
可使用本文中的方法轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括干細(xì)胞、祖細(xì)胞和分化細(xì)胞而無限制。干細(xì)胞具有通過許多次群體倍增(例如，至少60-80次)(在一些情況下基本上是無限的)而復(fù)制的能力，并且還具有分化成多種細(xì)胞類型的能力(例如，為多能性的(pluripotent)或多能的)。用目的化合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞還可能導(dǎo)致細(xì)胞變成永生化的(即，能夠倍增50次以上)。例如，已報(bào)導(dǎo)，使用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染可使神經(jīng)元祖細(xì)胞永生化(參見授予Goldman等人的美國專利7，150, 989)。
一些細(xì)胞類型對嚴(yán)格的轉(zhuǎn)染技術(shù)例如電穿孔或基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染非常敏感。例如，最近我們已發(fā)現(xiàn)人羊水干細(xì)胞(AFS)，在用電穿孔或基于脂質(zhì)體的試劑轉(zhuǎn)染后，通常會(huì)停止生長并且經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案,如本文中教導(dǎo)的轉(zhuǎn)染對更敏感的細(xì)胞例如AFS細(xì)胞的成活力、增殖和基本功能不具有顯著的影響。
在一些實(shí)施方案中，在液體載體中提供細(xì)胞。液體載體可以以懸浮液、溶液或任何適當(dāng)?shù)男问酱嬖?。液體載體的實(shí)例包括但不限于水、水溶液(例如，磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液等)、液體介質(zhì)(例如，改良伊格爾氏培養(yǎng)基("MEM" )、Hank' s平衡鹽等)、凝膠等，并且必要時(shí)可包含額外的成分。在一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞組合物中使用液體載體可確保足夠的水合作用和使打印后蒸發(fā)減少至最少。然而，在一些實(shí)施方案中，在任何給定的打印滴中獲得活細(xì)胞的概率隨著細(xì)胞濃度不斷減小也在減小。參見授予Boland等人的美國專利 7,051,654。
在一些實(shí)施方案中，可通過例如使用張應(yīng)力或切應(yīng)力或壓縮或慣性載荷或液體運(yùn)動(dòng)對細(xì)胞“施加應(yīng)力”來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)力可以是法向應(yīng)力或切應(yīng)力。在法向應(yīng)力中，應(yīng)力垂直于材料表面。切應(yīng)力("τ ")是指其中應(yīng)力(例如摩擦力)基本上與材料的表面(例如，細(xì)胞膜)平行或相切的應(yīng)力狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，迫使細(xì)胞通過噴口，以便細(xì)胞經(jīng)歷切應(yīng)力。在一些實(shí)施方案中，切應(yīng)力是0.5至SOOms'或I至lOOms—1或5至Mms'在一些實(shí)施方案中，對細(xì)胞施加應(yīng)力，進(jìn)行有限的時(shí)間，例如10_5至10_7秒。在一些實(shí)施方案中，有限的時(shí)間是0.5至10微秒。
噴嘴的理想大小將取決于打算轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型。作為一般指導(dǎo)，真核動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞直徑通常為10至100 μ m,原核細(xì)胞直徑通常為0.1至10 μ m。打印前，在一些實(shí)施方案中，可通過酶促作用使細(xì)胞例如從培養(yǎng)板或外植體組織分離。當(dāng)酶促處理時(shí)，細(xì)胞通常收縮成更小的球。作為一般指導(dǎo)，在酶促處理后，動(dòng)物細(xì)胞通常為數(shù)微米至30微米。例如，在胰蛋白酶處理后，豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系的細(xì)胞(PAEC細(xì)胞)為大約10-20 μ m。
在一些實(shí)施方案中，噴嘴直徑為10至200，或直徑為20至100 μ m，或30至70 μ m。在其他實(shí)施方案中，噴嘴直徑為大約40或50 μ m?？商峁?fù)數(shù)個(gè)具有相同或不同直徑的噴嘴。雖然在一些實(shí)施方案中，噴嘴具有圓形開口，但可使用其他適當(dāng)?shù)男螤?，例如橢圓形、正方形、矩形，而不背離本發(fā)明的精神。
以另一種方式來說，在一些實(shí)施方案中噴嘴大小不超過待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑
1、1.5、2、3、5、8、10或12倍。在其他實(shí)施方案中，噴嘴與待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑大小相同或比之更小，例如待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑大小的1/8、1/4、1/2、3/4或7/8。一些實(shí)施方案包括范圍在待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑的1/8和12倍之間，或1/4和10倍之間，或1/2和8倍之間的大小。
在另外的實(shí)施方案中，可將細(xì)胞暴露于高熱，例如高于50、80或100攝氏度。在其他實(shí)施方案中，將細(xì)胞暴露于高于120、150、180或200攝氏度的熱。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞暴露于高于220、250、280或300攝氏度的熱。例如，如下所論述的，將細(xì)胞和/或其中包含細(xì)胞的組合物與打印頭的加熱的板接觸，為了噴射細(xì)胞/組合物的小滴，加熱該板。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞暴露于熱，進(jìn)行有限的時(shí)間例如10_5至10_7秒。在一些實(shí)施方案中，有限的時(shí)間是0.5至10微秒。
根據(jù) 一些實(shí)施方案，在目的化合物存在的情況下，當(dāng)對細(xì)胞施加應(yīng)力和/或加熱時(shí)至少一部分細(xì)胞被轉(zhuǎn)染?？赏ㄟ^計(jì)算活細(xì)胞或貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染百分比或比率(例如，分別根據(jù)GFP-陽性或IacZ-陽性細(xì)胞與DAP1-陽性細(xì)胞之間的關(guān)系計(jì)算的)來測定轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞的部分。如本文中所使用的，“活的”包括附著至培養(yǎng)皿或其他基質(zhì)和/或能夠存活(例如，增殖的)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，至少0.5、I或2%的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。在其他實(shí)施方案中，至少3、4或5%的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。在其他實(shí)施方案中，至少6、7、8、10或12%的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。在其他實(shí)施方案中，至少15、20或30%或更多的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。
此外，可通過將活活細(xì)胞或貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率乘以各培養(yǎng)樣品的存活率(即，裝載的總細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染步驟后是活的百分比)來測定總轉(zhuǎn)染率。在一些實(shí)施方案中，至少15、20或25%的裝載的總細(xì)胞在轉(zhuǎn)染至少一部分細(xì)胞后是活的。在其他實(shí)施方案中，至少30、40或50%的所提供的總細(xì)胞是活的，在其他實(shí)施方案中，至少60、70、80或90%或更多的所提供的總細(xì)胞在轉(zhuǎn)染至少一部分細(xì)胞后是活的。細(xì)胞存活率可通過任何常規(guī)方法例如MTS測定法來測量。根據(jù)一些實(shí)施方案的總轉(zhuǎn)染率是至少1、2、4或8%，或至少10、15、20或30%或更多。
在一些實(shí)施方案中，用目的化合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可被遞送入基質(zhì)，包括3D支架，和可促進(jìn)工程組織和器官的形成和功能化。其他應(yīng)用的實(shí)例包括但不限于用至少一個(gè)目的化合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的2-維或3-維陣列。
通過噴墨打印進(jìn)行的轉(zhuǎn)染
在一些實(shí)施方案中，通過與目的化合物共打印來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用于活細(xì)胞的噴墨打印的方法和組合物是已知的并且描述于例如授予Boland等人的美國專利7，051, 654 ；Wilson 等人(2003)The Anatomical RecordPart A 272A:491-496 中。細(xì)胞還可通過其他方法打印，例如通過沉積活細(xì)胞來形成三維結(jié)構(gòu)的方法和組合物，如授予Warren等人的美國專利6，986，739中所描述的。
不期望受任何特定理論的束縛，假設(shè)借以通過噴墨打印轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可能機(jī)制包括可在噴墨打印過程中發(fā)生的高切應(yīng)力(在一些實(shí)施方案中達(dá)到IOmiT1)，和/或高熱(在一些實(shí)施方案中達(dá)到300攝氏度)，這導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞膜的物理-機(jī)械變化，該變化促進(jìn)目的化合物至細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移(圖1)。
可通過噴墨打印轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的實(shí)例包括真核細(xì)胞和原核細(xì)胞而無限制，如上所述?？墒褂帽疚闹械姆椒ㄞD(zhuǎn)染的真核細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括干細(xì)胞、祖細(xì)胞和分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過噴墨打印進(jìn)行的轉(zhuǎn)染是比較溫和的轉(zhuǎn)染條件。例如，在一些實(shí)施方案中打印后相對高的百分比的細(xì)胞是活的(例如，70、80或90 %或更多)。這對于更敏感的細(xì)胞例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)染是特別重要的。祖細(xì)胞被稱為具有高增殖能力、自我更新能力和多譜系分化(multilineagedifferentiation)潛能的未分化細(xì)胞。關(guān)于祖細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)染中的主要考慮問題是此類細(xì)胞在被轉(zhuǎn)染后是否可以仍然保持它們的干細(xì)胞或未分化狀態(tài)。溫和的噴墨打印轉(zhuǎn)染可保持祖細(xì)胞的該重要狀態(tài)。
再例如，最近我們已發(fā)現(xiàn)人羊水干細(xì)胞(AFS)，在通過電穿孔或基于脂質(zhì)體的試劑轉(zhuǎn)染后，會(huì)停止生長或甚至其大部經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。相反地，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的噴墨打印對AFS干細(xì)胞的成活力、增殖和基本功能不具有顯著影響。
在一些實(shí)施方案中，如上所述，可在液體載體中提供細(xì)胞和/或目的化合物。根據(jù)一些實(shí)施方案使用的目的化合物的濃度包括但不限于0.01至50 μ g/ μ L、0.05至10、15或20 μ g/ μ L、0.1或5 μ g/ μ L、0.1至2.0 μ g/ μ L和I至2 μ g/ μ L的組合物。根據(jù)一些實(shí)施方案的組合物中細(xì)胞的濃度包括但不限于大約105、106、107、08或IO9個(gè)細(xì)胞/mL。
可通過例如使用張應(yīng)力或切應(yīng)力，包括在噴墨打印過程中發(fā)生的壓縮或慣性載荷或液體運(yùn)動(dòng)對細(xì)胞施加應(yīng) 力來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施方案中，切應(yīng)力為0.5至δΟΟπ Γ1、或I至 IOOms-1 或 5 至 15ms-1。參見 Okamoto 等人(2000) Nature Biotechnology 18:438-441。
在一些實(shí)施方案中，可將細(xì)胞暴露于高熱，例如高于50、80或100攝氏度。在其他實(shí)施方案中，將細(xì)胞暴露于高于120、150、180或200攝氏度的熱。仍在其他實(shí)施方案中，將細(xì)胞暴露于高于220、250、280或300攝氏度的熱。在某些涉及噴墨打印的實(shí)施方案中，通過打印機(jī)墨盒的加熱的板來產(chǎn)生熱。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞暴露于熱，進(jìn)行有限的時(shí)間例如10_5至10_7秒。在其他實(shí)施方案中，有限的時(shí)間是0.5至10微秒。參見Calvert (2001)Chem.Mater.13:3299_3305。
在一些實(shí)施方案中，可用改進(jìn)的噴墨打印機(jī)通過噴墨打印來轉(zhuǎn)染目的化合物。改進(jìn)可以包括但不限于指，控制溫度、濕度、切應(yīng)力、打印速度和噴射頻率的方式，通過例如改進(jìn)打印機(jī)驅(qū)動(dòng)程序和/或打印機(jī)的物理構(gòu)造來實(shí)現(xiàn)。參見，例如，Pardo等人(2003)Langmuir 19:1462-1466 ;授予Boland等人的美國專利7，051，654。并非每一個(gè)這些參考資料中提及的改進(jìn)都將適合于給定的應(yīng)用，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)該是可理解的。例如，在一些實(shí)施方案中，不使用具有更緊的公差(tolerance)(通過加入橫向支持物(horizontal support)，將電路中的晶體管改變換成具有更高放大倍數(shù)的晶體管，然后再加入水平位置編碼器(horizontalposition encoder)產(chǎn)生)的齒輪固定柱(gear mountpillar)來改進(jìn)打印機(jī)。同樣，在一些實(shí)施方案中，不通過改進(jìn)打印機(jī)程序以降低電阻式電壓來避免使溶液加熱超過37 °C。
在一些實(shí)施方案中，可如下改進(jìn)打印機(jī)(例如，商業(yè)打印機(jī)HP695C和HP550C)?？扇サ舸蛴C(jī)頂蓋(top cover),停用(disable)用于頂蓋的感應(yīng)器?？赏Ｓ眉垯C(jī)械裝置以允許將細(xì)胞打印至固體基質(zhì)(例如，玻璃蓋玻片)上?？扇サ裟諌|(ink absorbingpad)(在HP695C和HP550C打印機(jī)的右側(cè)上)(例如，以避免墊子在打印過程中污染打印墨盒的底部)。為了給打印機(jī)提供打印3D結(jié)構(gòu)的能力，可為改進(jìn)的打印機(jī)加入具有受控升降室(elevator chamber)的定制的Z軸組件。
在打印頭中噴口噴射過程中，可將目的化合物轉(zhuǎn)染入活細(xì)胞?！按蛴☆^”是噴墨打印機(jī)中噴射微滴(例如，墨水)的裝置。在一些實(shí)施方案中，將目的化合物與打算轉(zhuǎn)染的細(xì)胞一起裝載入墨水墨盒中。在其他實(shí)施方案中，在裝載之前將細(xì)胞與目的化合物預(yù)先混合。在其他實(shí)施方案中，相繼裝載細(xì)胞和目的化合物，以便裝載的組合物包含細(xì)胞和目的化合物。
在一些實(shí)施方案中，噴墨打印裝置是感熱式噴墨打印機(jī)。一般地，在感熱式噴墨打印機(jī)中，電阻器在打印頭中產(chǎn)生熱，蒸發(fā)墨水以產(chǎn)生熱泡。隨著熱泡膨脹，其中一些墨水被擠出噴口至紙上。當(dāng)泡崩塌時(shí)產(chǎn)生真空，這將推動(dòng)更多的墨水從墨盒進(jìn)入打印頭。在本發(fā)明中，用例如細(xì)胞和/或目的化合物(例如，液體載體中的)替換墨水，用適當(dāng)?shù)幕|(zhì)例如瓊脂或膠原包被的基質(zhì)替代紙。參見，例如，授予Niklasen等人的美國專利6，537，567。
在一些實(shí)施方案中，通過用噴墨打印頭(例如，51626a或51629a，HewlettPackard, Palo Alto, California)打印至基質(zhì)上(例如，組織或支架)來轉(zhuǎn)染目的化合物轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施方案中，打印頭具有擁有許多行和/或噴頭的面板。在某些實(shí)施方案中，面板具有兩行25噴嘴或噴口。
在一些實(shí)施方案中，噴口直徑為0.05至200 μ m,或直徑為0.5至100 μ m，或10至70 μ m，或直徑為20至60 μ m。在其他實(shí)施方案中，噴口直徑為大約40或50 μ m?？商峁?fù)數(shù)個(gè)具有相同或不同直徑的噴口。雖然在一些實(shí)施方案中噴口具有圓形開口，但通過考慮打算轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的相對大小，也可使用其他適當(dāng)?shù)男螤?，例如，橢圓形、正方形、矩形等而不背離本發(fā)明的精神。作為一般指導(dǎo)，真核動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞直徑通常為10至ΙΟΟμπι，原核細(xì)胞直徑通常為0.1至10 μ m。在打印前，在一些實(shí)施方案中，可通過酶促作用從例如培養(yǎng)板或外植體組織分離細(xì)胞。在酶促處理后，細(xì)胞通常收縮成更小的球形。作為一般指導(dǎo)，在酶促處理后，動(dòng)物細(xì)胞通常為數(shù)微型米至30微米。例如，在胰蛋白酶處理后，豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系的細(xì)胞(PAEC細(xì)胞)為大約10-20 μ m。
換種方式說，在一些實(shí)施方案中噴嘴大小不超過待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑1.5、2、
3、5、7、10、15或20倍。例如，HP 51629a和HP 51626a墨盒的噴口分別為大約40和50微米(參見Xu等人(2006)Biomaterials27(19):3580-88)。因此，在一些實(shí)施方案中，相對噴口大小是待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的直徑的1.3至10倍。在另外的實(shí)施方案中，相對噴口大小是待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞直徑的0.8至20倍。
在其他實(shí)施方案中，噴嘴與待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑大小相同或比之更小，例如為待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑大小的1/8、1/4、1/2、3/4或7/8。一些實(shí)施方案包括范圍在待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的平均直徑的1/8和12倍之間，或1/4和10倍之間，或1/2和8倍之間的大小。
在一些實(shí)施方案中，各噴嘴與打印頭中的分離槽(separate chamber)連接。根據(jù)一些實(shí)施方案，在打印過程中，單個(gè)細(xì)胞和裝載的目的化合物可以只通過眾多噴口和槽中的一個(gè)，從而可在任何一個(gè)噴口內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施方案中，打印頭能夠每秒打印250，000個(gè)以上的小滴，從而提供了高通量基因轉(zhuǎn)染的方法。
在其他實(shí)施方案中，通過用壓電 晶體振動(dòng)打印頭(piezoelectriccrystalvibration print head)打印來轉(zhuǎn)染目的化合物。通常，壓電晶體接收使其振動(dòng)，從而將墨水壓擠出噴口，并且將更多的墨水吸入貯液器(reservoir)的電荷。在本發(fā)明中，用例如存在于液體中的細(xì)胞和/或目的化合物替代墨水。與感熱式噴墨打印相比較，基于壓力的噴墨打印通常需要更大功率和更高的振動(dòng)頻率。典型商業(yè)壓電式打印機(jī)(piezo-printer)使用高至30kHz的頻率和范圍在12至100W內(nèi)的電源。通常使用范圍在15至25kHz內(nèi)的振動(dòng)頻率和10至375W的電源來破壞細(xì)胞膜。(See Xu等人(2005)Biomaterials 26:93-99)。因此，在一些實(shí)施方案中，使用壓電晶體振動(dòng)打印頭，其振動(dòng)頻率為1、5、10或15，至20、25、30 或 35 或更高的 kHz,電源為 5、10、20、50、100、120 或 150 至 200、250、300、350 或 375 或更多瓦特。
根據(jù)一些實(shí)施方案，至少一部分活細(xì)胞在與目的化合物共打印時(shí)被轉(zhuǎn)染?？赏ㄟ^計(jì)算活細(xì)胞或貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染百分比或轉(zhuǎn)染率(例如，分別根據(jù)GFP-陽性或IacZ-陽性細(xì)胞與DAP1-陽性細(xì)之間關(guān)系計(jì)算的)來測定轉(zhuǎn)染的活細(xì)胞的的部分。“活細(xì)胞”包括粘附至培養(yǎng)皿或其他基質(zhì)和/或能夠存活(例如，增殖)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，至少0.5、1或2%的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。在其他實(shí)施方案中，至少3、4或5%的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。在其他實(shí)施方案中，至少6、7、8、10或12%的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。在另外的實(shí)施方案中，至少15、20或30%或更多的活細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。此外，總轉(zhuǎn)染率可通過將活細(xì)胞或貼壁細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率乘以各培養(yǎng)樣品的存活率(如上)來測定。在一些實(shí)施方案中，至少15、20或25%的裝載的總細(xì)胞在轉(zhuǎn)染至少一部分細(xì)胞后是活的。在其他實(shí)施方案中，至少30、40或50%的裝載的總細(xì)胞是活的，在其他實(shí)施方案中，至少60、70、80或90%或更多的裝載的總細(xì)胞在轉(zhuǎn)染至少一部分細(xì)胞后是活的。細(xì)胞存活率可通過任何常規(guī)方法例如MTS測定法來測量。根據(jù)一些實(shí)施方案的總轉(zhuǎn)染率是至少1、2、4或8%，或至少10、15、20或30%或更多。
可在打印過程 中和/或之后將不同機(jī)制用于促進(jìn)細(xì)胞的存活。特別地，可利用通過提供水合作用、營養(yǎng)物和/或結(jié)構(gòu)支持來支持打印細(xì)胞的化合物?？墒褂贸Ｒ?guī)技術(shù)例如通過手工在清洗或水浴中將此類化合物用于基質(zhì)，通過蒸汽淀積(例如，物理或化學(xué)蒸汽淀積)等將此類化合物用于基質(zhì)。此類化合物還可在打印之前和/或期間與細(xì)胞組合物組合，或被打印或否則應(yīng)用至底物(例如，包被的)作為在細(xì)胞層下面、上面和/或之間的隔離層。例如，一種這樣的支持性化合物是粘性低至足以在打印條件下通過打印頭的噴口并且可在打印期間和/或打印后膠凝成穩(wěn)定的形狀的凝膠。這樣的粘性通常在大約0.5至大約50厘泊的范圍內(nèi)，在一些實(shí)施方案中，大約I至大約20厘泊的范圍內(nèi)，以及在一些實(shí)施方案中，大約I至大約10厘泊。些可用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)哪z的一實(shí)例包括但不限于瓊脂、膠原、水凝膠等。
除了凝膠以外，還可在本發(fā)明中使用其他支持性化合物。例如可將細(xì)胞外基質(zhì)與支持性凝膠組合來最優(yōu)化或功能化凝膠。在一些實(shí)施方案中，還可將一種或更多種生長因子導(dǎo)入打印陣列。例如，可將以不同濃度和順序包含一種或更多種生長因子的緩釋微球與細(xì)胞組合物和/或目的化合物組合物組合以加速和指導(dǎo)細(xì)胞融合過程。其他適當(dāng)?shù)闹С中曰衔锟砂ㄓ兄诒苊饧?xì)胞凋亡和發(fā)育中結(jié)構(gòu)的壞死的支持性化合物。例如，可加入存活因子(例如，基本的成纖維細(xì)胞生長因子)。此外，可在打印組合物中包含具有凋亡抑制(antiapoptotic)(例如，bcl_2和端粒酶)和/或阻斷途徑的細(xì)胞的瞬時(shí)遺傳修飾。還可利用膠粘劑來在打印后幫助細(xì)胞的存活。例如，軟組織粘合劑例如氰基丙烯酸酯、血纖蛋白粘合劑和/或組織粘合劑-雷鎖辛-甲醛膠凍可用于約束新生結(jié)構(gòu)以避免在層的打印后被洗去或移動(dòng)。此外，粘合劑例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)配體可增強(qiáng)細(xì)胞至膠凝聚合物或其他支持化性合物的粘著。此外，還可利用細(xì)胞外蛋白、細(xì)胞外蛋白類似物等。
如本文所使用的，“生長因子”可以是適合于將被打印的特定組織或陣列的任何天然發(fā)生的或合成的生長因子，包括其組合。許多生長因子對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。實(shí)例包括但不限于胰島素樣生長因子(例如，IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、成纖維細(xì)胞生長因子、血小板衍生的生長因子(TOGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、基本的成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)(成員1、2和3)、骨橋蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2)、生長激素例如促生長素、細(xì)胞引誘劑(cellular attractant)和附著劑(attachment agent)等和其混合物。參見例如美國專利7,019, 192 ;6，995，013 ；和6，923，833例如，可在打印組合物中提供生長因子蛋白和/或由被轉(zhuǎn)染入打印細(xì)胞的質(zhì)粒編碼其。
在一些實(shí)施方案中，取決于將要形成的特定組織(或組織替代物)，可從分開的噴口或通過相同噴口(當(dāng)共同存在于組合物中時(shí))打印目的化合物、細(xì)胞、支持性化合物和/或生長因子。打印可以是同時(shí)地、順次地或其任何組合。一些成分可以以第一模式(例如，可腐蝕的或可降解的材料)的形式打印，一些成分可以以第二模式(例如，在與支持物不同的模式中的細(xì)胞，或在不同模式中的兩種不同的細(xì)胞類型)的形式打印。打印的特定組合和方式將取決于將被打印的特定組織。
可將根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于例如組織工程應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞和目的化合物打印入基質(zhì)，例如生物相容性支架，所述基質(zhì)隨后可被植入有此需要的受試者。在其他實(shí)施方案中，可在之前已應(yīng)用或未應(yīng)用細(xì)胞可附著在其中的基質(zhì)(例如，血纖蛋白層)的情況下，將細(xì)胞和目的化合物體內(nèi)直接在體內(nèi)打印至活組織上。
在下列非限定性實(shí)施例中更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。 實(shí)施例
此處，我們報(bào)告了通過使用噴墨打印法進(jìn)行的活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染的新型通用方法。我們假設(shè)當(dāng)將目的基因與活細(xì)胞通過噴射式噴墨噴口被共打印時(shí)，目的基因可有效地遞送入活細(xì)胞，并且被導(dǎo)入的基因可在體外和體內(nèi)表達(dá)。此外，可在轉(zhuǎn)染過程中，利用噴墨打印將細(xì)胞遞送至預(yù)先指定的靶位點(diǎn)。
可能的轉(zhuǎn)染機(jī)制示于圖1中。不希望受任何特定理論的束縛，據(jù)認(rèn)為，當(dāng)細(xì)胞和質(zhì)粒在打印過程中通過打印頭的墨水通道時(shí)，當(dāng)噴口噴射時(shí)發(fā)生的高切應(yīng)力和/或熱可引起細(xì)胞膜的短暫微小破壞，從而允許質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入細(xì)胞。
實(shí)施例1.通過共打印進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)染。使用豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系(PAEC)，該細(xì)胞系是之前在我們實(shí)驗(yàn)室通過酶促分散成體豬的主動(dòng)脈而建立的，細(xì)胞系的第15、16和17代用于基因轉(zhuǎn)染。將PAEC細(xì)胞在37°C下于潮濕的5% CO2 (95%空氣)氣氛中維持在補(bǔ)充有10%胎牛血清(GIBCO)以及100IU青霉素和100mg/ml鏈霉素的F12培養(yǎng)(GIBC0，Invitrogen, Carlsbad, CA)中。
使用編碼cDNA的細(xì)胞巨化病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒。將pmaxGFP (Amaxa GmbH, Germany,和 Gaithersburg, Maryland)、pIRES-VEGF-GFP (BDBiosciences, Bedford, MA)和 pIRES-lacZ(BCCM/LMBP, Belgium)質(zhì)粒各自在大腸桿菌的DH5a菌株中進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過堿性裂解分離，利用離子交換柱層析(Qiagen Inc.,Valencia, CA)進(jìn)行純化。pmaxGFP 質(zhì)粒編碼來自燒腳類動(dòng)物羽小角水蚤(Potellinap.)的綠色熒光蛋白(GFP)。
為了進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，我們改進(jìn)商業(yè)HP Desktop打印機(jī)(695C和550C)和墨盒(HP51629a或51626a)。簡而言之，去掉打印機(jī)頂蓋，停用用于機(jī)蓋的感應(yīng)器?？赏Ｓ眠M(jìn)紙機(jī)械裝置以允許將細(xì)胞打印至固體基質(zhì)例如，玻璃蓋玻片上。去掉打印機(jī)右側(cè)上的墨水吸收墊以避免墊子在打印過程中污染打印盒的底部。為了給打印機(jī)提供打印3D結(jié)構(gòu)的能力，可給改進(jìn)的打印機(jī)中加入具有受控升降室的定制的Z軸組件。打印機(jī)使用允許打印不同粘性的溶液的打印驅(qū)動(dòng)程序。打印機(jī)驅(qū)動(dòng)程序持續(xù)地調(diào)整至噴口的電壓以補(bǔ)償不同的溶液阻抗(impedance),從而使得能夠分配適當(dāng)量的溶液。也參見Pardo等人(2003) Langmuir 19:1462-1466);授予Boland等人的美國專利7，051，654 (注意,并非所有Pardo等人和Boland等人的參考資料中找到的改進(jìn)都可使用，例如，不通過使用具有更緊的公差(通過加入水平位置編碼器導(dǎo)致的)的新型齒輪固定柱來改進(jìn)打印機(jī)，以及不通過降低電阻式電壓來避免使溶液加熱超過37 °C。)。
在導(dǎo)入細(xì)胞打印懸浮液之前，用乙醇和無菌水充分漂洗墨盒。通過使用icrosoftPowerPoint為打印機(jī)編程來設(shè)計(jì)正方形的模式。通過使用之前報(bào)導(dǎo)的方案(Shea等人(1999)Nat Biotechnol 17,551-554)從大鼠尾巴I型膠原凝膠制備基質(zhì)。在用胰蛋白酶處理后，收集PAEC細(xì)胞沉淀，然后以1.5-2X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸浮于Nucleofector 溶液(Amaxa)中。將質(zhì)粒以0.1 μ g/ μ I至2 μ g/ μ I范圍內(nèi)的濃度加入細(xì)胞懸浮液中。
將含有PAEC細(xì)胞和質(zhì)粒的打印懸浮液裝載入墨盒。當(dāng)噴口噴射時(shí)，細(xì)胞和質(zhì)?；旌衔锉淮蛴≈聊z原凝膠包被的基質(zhì)上。在37°C下于潮濕的5% CO2(95%空氣)氣氛中溫育30分鐘后，小心地將培 養(yǎng)基加至皿中以避免擾動(dòng)打印的細(xì)胞模式。作為對照，將PAEC細(xì)胞和質(zhì)粒混合在一起，然后手工接種在膠原凝膠包被的基質(zhì)上。它們保持與打印組相同的細(xì)胞密度和質(zhì)?；驖舛取Ｃ刻焱ㄟ^光學(xué)和熒光顯微鏡監(jiān)控細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染和生長。
我們發(fā)現(xiàn)在5-7小時(shí)后，打印細(xì)胞開始表達(dá)GFP?？稍谂囵B(yǎng)物中清晰地觀察到綠色熒光，在10天的時(shí)期中持續(xù)看到強(qiáng)GFP表達(dá)(圖2a-c)。然而，在非打印對照組中未看到GFP基因表達(dá)，或如果有的話，也是其極少的表達(dá)。
實(shí)施例2.與普通轉(zhuǎn)染方法的比較。我們還將噴墨打印法的細(xì)胞存活率和轉(zhuǎn)染率與組織工程中常用的其他化學(xué)和物理轉(zhuǎn)染法相比較。為此目的，進(jìn)行基于常用脂質(zhì)體的試劑和電穿孔法。將Lipofectamine 2000 (Invitrogen)( 一種基于常用脂質(zhì)體的試劑)和Nucleofection ( 一種電穿孔法)與使用PAEC細(xì)胞培養(yǎng)物的打印法進(jìn)行比較。
對于使用Lipofectamine 試劑的轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前一天，將PAEC細(xì)胞以2X105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在24孔板上。按照廠商的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染。簡而言之，將0.8ygpmaxGFP (Amaxa)和等量的Lipofectamine 2000試劑各自加至50 μ I的無血清F12培養(yǎng)基中。在于室溫(RT)下溫育5分鐘后，將它們混合，然后再于室溫(RT)下溫育20分鐘。向24孔板中加入該DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，并且維持達(dá)到48小時(shí)。
在Nucleofection實(shí)驗(yàn)中，使用用于原代哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞的BasicNucleofector 試劑盒(Amaxa)。為了幫助用戶更有效地使用 BasicNucleofector 試劑盒產(chǎn)品，提供商(Amaxa)已試驗(yàn)了細(xì)胞并且建立了含有幫助使用轉(zhuǎn)染試劑盒的程序的數(shù)據(jù)庫。W-023和Y-022的程序包括在數(shù)據(jù)庫中，其為特別地針對原代哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞設(shè)計(jì)的。在這些實(shí)驗(yàn)中用于噴墨打印的細(xì)胞也是哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞。這兩個(gè)程序都設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)染來自豬主動(dòng)脈的原代內(nèi)皮細(xì)胞。
程序W-023在PACE細(xì)胞的存活率和轉(zhuǎn)染率方面顯示更好的結(jié)果，從而用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。按照廠商的方案對內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在胰蛋白酶處理后，將分離的細(xì)胞在培養(yǎng)基中調(diào)整至5X IO5的體積。之后，離心細(xì)胞，除去培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸浮于含有3yg質(zhì)粒DNA的100 μ I的Nucleofector 溶液。在電脈沖后，立即加入500 μ I含有10% FBS的F12培養(yǎng)基(Gibco)以中和Nucleofector 溶液。將細(xì)胞接種在裝有預(yù)溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿上，在進(jìn)一步分析前于潮濕的37°C /5% CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)中溫育24小時(shí)。
對于各基因轉(zhuǎn)染方法，在轉(zhuǎn)染后，通過按照廠商的方案，使用四唑鹽化合物(MTS)測定法(Sigma-Aldrich)評估細(xì)胞存活率。簡而言之，按每ml培養(yǎng)基向轉(zhuǎn)染的樣品和非轉(zhuǎn)染樣品加入500ml試劑。在單個(gè)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，使用上述轉(zhuǎn)染方法制備轉(zhuǎn)染樣品，為了估計(jì)總細(xì)胞數(shù)目，也使用除了它們不經(jīng)歷轉(zhuǎn)染過程外，與轉(zhuǎn)染樣品相同的條件來制備非轉(zhuǎn)染樣品。在樣品于室溫下黑暗處溫育2小時(shí)后，使用分光光度計(jì)測量540nm處的吸光率。根據(jù)轉(zhuǎn)染樣品的吸光率與非轉(zhuǎn)染樣品的吸光率之間的關(guān)系來估計(jì)在3種不同的轉(zhuǎn)染方法中裂解的百分比。
在24-48小時(shí)的培養(yǎng)后，用PBS充分清洗轉(zhuǎn)染親品以除去裂解的或非貼壁細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定。使用DAPI染色(10mg/ml)估計(jì)培養(yǎng)中物中活細(xì)胞的總數(shù)目。對于使用GFP (包括pmaxGFPTM和VEGF-GFP質(zhì)粒)的轉(zhuǎn)染，計(jì)數(shù)GFP-陽性綠色突光細(xì)胞以測量轉(zhuǎn)染率。對于使用IacZ的轉(zhuǎn)染,使用X-gal染色(Boehringer Mannheim,Indianapolis, IN)估量細(xì)胞β -半乳糖苷酶活性，表達(dá)IacZ基因的細(xì)胞被染成藍(lán)色。計(jì)數(shù)IacZ-陽性藍(lán)色 染色的細(xì)胞以估計(jì)轉(zhuǎn)染率。使用倒置Zeiss熒光顯微鏡(CarlZeiss，Inc.，Thornwood, New York)以10X放大倍數(shù)來計(jì)數(shù)細(xì)胞。在每一個(gè)孔中隨機(jī)選擇4個(gè)視野,對于每一個(gè)樣品計(jì)數(shù)至少4至6個(gè)孔。根據(jù)GFP-陽性或IacZ-陽性細(xì)胞與DAP1-陽性細(xì)胞之間的關(guān)系計(jì)算活細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率?？傓D(zhuǎn)染率通過將活細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率乘以各培養(yǎng)樣品的存活率來估計(jì)。
與兩個(gè)常用的化學(xué)和物理方法相比較，噴墨法在打印和轉(zhuǎn)染活細(xì)胞后展示顯著更高的細(xì)胞存活率(圖2d)。在打印和轉(zhuǎn)染過程中多至90%以上的細(xì)胞未被裂解。這與之前報(bào)導(dǎo)的存活率結(jié)果一致(參見Xu等人(2005)Biomaterials 26,93-99 ;Nakamura等人(2005)Tissue Eng 11，1658-1666)并且也再次驗(yàn)證了噴墨打印法是引起打印細(xì)胞最少損害的溫和處理(Xu 等人(2006)Biomaterials 27,3580-3588)。
在I天的培養(yǎng)后，用HP695C打印機(jī)打印的活細(xì)胞+pmaxGFP 在熒光顯微鏡下顯現(xiàn)綠色，表明在打印過程中，GFP基因有效地在打印細(xì)胞中表達(dá)(圖3)。用HP550C打印機(jī)打印的細(xì)胞+pmaxGFP 質(zhì)粒(Amaxa Biosystems, Gaithersburg,Maryland)在第 2 天(圖 4)和第4天(圖5)也顯示GFP表達(dá)。用HP550C打印機(jī)打印的細(xì)胞+編碼GFP和VEGF的質(zhì)粒在第2天(圖6)顯示GFP表達(dá)。
在轉(zhuǎn)染過程中，一些細(xì)胞被裂解(死亡)，這些死亡的細(xì)胞大部分不粘附至培養(yǎng)皿并且可從培養(yǎng)皿中清洗掉。為了估計(jì)轉(zhuǎn)染率，用PBS充分清洗轉(zhuǎn)染樣品以除去裂解的細(xì)胞。在給定的培養(yǎng)皿中，將清洗步驟后總細(xì)胞的數(shù)目計(jì)數(shù)為N。(該數(shù)目應(yīng)當(dāng)接近，但不等于活細(xì)胞的數(shù)目，因?yàn)樗劳黾?xì)胞不能被100%清洗掉，并且少量活細(xì)胞可被清洗掉)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的數(shù)目(例如，對于GFP是陽性的)計(jì)數(shù)為Ντ?；罴?xì)胞的轉(zhuǎn)染率意指轉(zhuǎn)染細(xì)胞對培養(yǎng)皿中的活細(xì)胞的百分比?；罴?xì)胞的轉(zhuǎn)染率=Ντ/Ν。。總轉(zhuǎn)染率意指轉(zhuǎn)染細(xì)胞對一開始被打印在基質(zhì)(培養(yǎng)皿)上的總細(xì)胞的百分比?？傓D(zhuǎn)染率=活細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率X存活率(％ )。
我們發(fā)現(xiàn)，多至12%的打印細(xì)胞已被質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染。噴墨基因轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)表明噴墨打印法，包括熱激法(heat shock)和剪切沖擊法(shearshock),促進(jìn)了質(zhì)粒進(jìn)入打印細(xì)胞。然而，與噴墨轉(zhuǎn)染法相關(guān)的確切機(jī)制需要進(jìn)一步研究。如圖2e中所示，噴墨轉(zhuǎn)染法對使用pmaxGFP 的轉(zhuǎn)染的總效率顯著少于基于電穿孔的方法，但高于基于脂質(zhì)體的方法。
實(shí)施例3.墨盒、質(zhì)粒的濃度和大小的比較。還就噴墨基因轉(zhuǎn)染檢測不同的HP墨盒。HP 51629a墨盒顯示比HP 51626a墨盒更高的基因轉(zhuǎn)染率，如圖2g中所示。HP51629a和HP 51626a墨盒共有許多相似的參數(shù)和機(jī)制，但在噴口大小上具有差異。據(jù)信，HP 51629a墨盒具有與比HP 51626a墨盒相對更小的噴口直徑，這可引起更高的應(yīng)力，從而導(dǎo)致更高的轉(zhuǎn)染率。在胰蛋白酶處理后，PAEC細(xì)胞為大約10-20 μ m。HP51629a和HP51626a墨盒的噴口分別為大約40和50微米(參見Xu等人，Biomaterials (2006) 27 (19):3580-88)。
`[0092]還發(fā)現(xiàn)，幾種其他因此可影響轉(zhuǎn)染。可試驗(yàn)打印懸浮液中不同的質(zhì)粒濃度。如較圖2f中所示，pmaxGFP 在其更高濃度(1.0 μ g/ μ I和2.0 μ g/ μ I)上的基因表達(dá)水平顯著高于在其在更低濃度(0.1 μ g/μ I和0.5 μ g/μ I)上的基因表達(dá)水平。這可能由于當(dāng)墨水通道中存在更高基因質(zhì)粒比率時(shí)，在噴口噴射過程中質(zhì)粒接近細(xì)胞膜并且進(jìn)入細(xì)胞的概率更高而導(dǎo)致。
此外,還可試驗(yàn)不同大小的質(zhì)粒。已看到，具有相對小的大小(3.2kb)的pmaxGFP 質(zhì)粒具有比其他兩種相對較大的質(zhì)粒(pIRES-VEGF-GFP和pIRES-lacZ)更高的轉(zhuǎn)染率(圖1h)?？赡艿脑蚴窃诒狙芯恐芯哂邢鄬^低功率的噴墨打印機(jī)只能在細(xì)胞膜中打開更小的微孔，從而更大的基因質(zhì)粒難以進(jìn)入細(xì)胞。為了用更大的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化特定的打印參數(shù)和條件，例如溫度、噴射頻率和墨盒通道的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。
實(shí)施例4.體內(nèi)噴墨基因轉(zhuǎn)染。為了評估噴墨基因轉(zhuǎn)染是否可在體內(nèi)進(jìn)行，將血纖蛋白凝膠直接打印入裸小鼠皮下組織，然后直接將PAEC細(xì)胞和pmaxGFP 質(zhì)粒一起直接打印在預(yù)先形成的血纖蛋白凝膠上。為了區(qū)分移植細(xì)胞和宿主動(dòng)物中的天然細(xì)胞，用PKH67紅色熒光染料(Sigma-Aldrich，St.Louis, MO)標(biāo)記PAEC細(xì)胞。按照ACUC方案在WakeForest University Health Sciences 進(jìn)行所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
用胰蛋白酶處理PAEC細(xì)胞，然后用無血清DMEM進(jìn)行清洗。將細(xì)胞以IXlO7個(gè)細(xì)胞 /ml 的濃度懸浮于 2 X lCr6mM PKH67 稀釋劑 C 溶液(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)中，在室溫下溫育4小時(shí)。通過加入等體積的補(bǔ)充有10% FBS的DMEM淬滅染色反應(yīng)，然后進(jìn)行清洗。在培養(yǎng)基下培養(yǎng)過夜后，PKH67標(biāo)記的PAEC細(xì)胞可直接用于下述的體內(nèi)直接打印。
通過PAEC細(xì)胞與質(zhì)粒DNA至無胸腺小鼠的皮下組織內(nèi)的直接打印來估量由噴墨打印誘導(dǎo)的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染的能力。在打印前，用如上所述的PKH67熒光染料標(biāo)記細(xì)胞以確定移植(打印的)細(xì)胞在宿主內(nèi)的定位。將血纖蛋白原(20mg/ml,溶解于PBS中)(Sigma)和凝血酶(20IU/ml于40mM CaCl2中)(Sigma)交替地打印入小鼠皮下組織以產(chǎn)生血纖蛋白凝膠支架，然后將PAEC和pmaxGFP 質(zhì)粒共打印在血纖凝膠上。重復(fù)該步驟兩次，從而產(chǎn)生具有某種結(jié)構(gòu)的包含轉(zhuǎn)染細(xì)胞的3D血纖蛋白層。在植入I周后，取回體內(nèi)打印的血纖蛋白層，并且立即在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢查。
在體內(nèi)直接打印后，直接在小鼠皮下組織原位形成了具有某種結(jié)構(gòu)的3D血纖蛋白凝膠，如圖7a-b中所顯示的。在綠色熒光顯微鏡(激發(fā)488nm ;發(fā)射515 545nm)(圖7c)下清楚地在血纖蛋白凝膠中看到表達(dá)GFP基因的打印細(xì)胞。此外，還在紅色熒光顯微鏡(激發(fā)560nm ;發(fā)射583nm)(圖7d)下看見所述細(xì)胞呈現(xiàn)紅色,從而確認(rèn)GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞不是來自天然組織而是來自通過噴墨打印機(jī)遞送的移植細(xì)胞。
本研究顯示了令人興奮的使噴墨技術(shù)適合進(jìn)行用于組織工程應(yīng)用的轉(zhuǎn)染的改造。除了具有精確遞送細(xì)胞群體至它們的靶位點(diǎn)的能力以外，噴墨打印還可有助于對于活細(xì)胞的特定功能和作用。目的基因可被遞送入細(xì)胞，并且細(xì)胞可在體外和體內(nèi)表達(dá)所述基因。此夕卜，通過使用噴墨法和如本研究中所示的體內(nèi)直接打印進(jìn)行的原位裝配可提供在體內(nèi)裝配特定細(xì)胞池(cell reservoir)(其中轉(zhuǎn)染細(xì)胞以正確的空間區(qū)劃定位，并且產(chǎn)生組織形成和再生所需的持續(xù)和受控的生長因子)的可能性。
上述內(nèi)容是本發(fā)明的舉例說明， 并且將不能理解為對其的限定。本發(fā)明由下列權(quán)利要求
來定義,權(quán)利要求
的等同物將包含在本文中。
權(quán)利要求
1.用核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其中至少一部分所述細(xì)胞被所述核酸轉(zhuǎn)染，所述方法包括步驟: 在液體載體中在所述核酸存在的情況下提供包含所述細(xì)胞的組合物；和迫使所述組合物通過噴嘴，以便在所述核酸存在的情況下使所述細(xì)胞經(jīng)歷0.5至500ms-1的切應(yīng)力，其中所述噴嘴的直徑在所述細(xì)胞平均直徑的1/8和12倍之間，并且其中對所述細(xì)胞施壓0.1至10微秒； 其中通過用噴墨打印裝置噴墨打印所述細(xì)胞來進(jìn)行所述迫使步驟， 從而用所述核酸轉(zhuǎn)染至少一部分所述細(xì)胞。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中在所述迫使步驟后存活的、至少1%的細(xì)胞被所述核酸轉(zhuǎn)染。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中在所述迫使步驟后存活的、至少5%的細(xì)胞被所述核酸轉(zhuǎn)染。
4.權(quán)利要求
1的方法，其中在所述迫使步驟后存活的、至少10%的細(xì)胞被所述核酸轉(zhuǎn)染。
5.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中在所述提供步驟中至少25%的細(xì)胞在所述迫使步驟后是活的。
6.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中在所述提供步驟中至少50%的細(xì)胞在所述迫使步驟后是活的。`
7.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中在所述提供步驟中至少90%的細(xì)胞在所述迫使步驟后是活的。
8.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行所述迫使步驟I至100微秒的時(shí)間。
9.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中所述提供步驟的所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中所述提供步驟的所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。
11.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)行所述迫使步驟，以便所述細(xì)胞經(jīng)歷I至IOOms-1的切應(yīng)力。
12.權(quán)利要求
1至4的任一項(xiàng)的方法，其中預(yù)先混合所述提供步驟的所述組合物。
13.權(quán)利要求
1的方法，其中所述噴墨打印裝置選自感熱式噴墨打印機(jī)和壓電式噴墨打印機(jī)。
14.權(quán)利要求
1的方法，其中所述噴墨打印裝置包括至少一個(gè)噴墨打印機(jī)墨盒，以及其中所述噴墨打印機(jī)墨盒選自感熱式噴墨打印機(jī)墨盒和壓電式噴墨打印機(jī)墨盒。
15.權(quán)利要求
1的方法，其中在所述迫使步驟中使所述細(xì)胞暴露于高于50攝氏度的熱。
16.權(quán)利要求
1的方法，其中在所述迫使步驟中使所述細(xì)胞暴露于高于120攝氏度的熱。
17.權(quán)利要求
1的方法，其中在所述迫使步驟中使所述細(xì)胞暴露于高于220攝氏度的熱。
18.權(quán)利要求
1的方法，其中進(jìn)行所述迫使步驟，使得所述細(xì)胞經(jīng)歷I至IOOmiT1的切應(yīng)力，對所述細(xì)胞施壓0.5至10微秒，并且使所述細(xì)胞暴露于高于220攝氏度的熱。
19.權(quán)利要求
1的方法，其中所述噴嘴的直徑是30-70微米。
20.權(quán)利要求
1的方法，其中通過將所述組合物打印至體內(nèi)組織基質(zhì)上來進(jìn)行所述打印。
21.權(quán)利要求
1的方法，其中所述打印是通過將所述組合物打印在以有組織的模式存在的基質(zhì)上而進(jìn)行的。
22.權(quán)利要求
20的方法，其中所述打印是通過將所述組合物打印在以有組織的模式存在的所述基質(zhì)上而進(jìn)行的。
23.權(quán)利要求
21的方法，其中所述基質(zhì)是用膠原包被的。
24.權(quán)利要求
22 的方法，其中所述基質(zhì)是用膠原包被的。
專利摘要
本文提供了通過對細(xì)胞施加應(yīng)力例如使用切應(yīng)力來用目的化合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法和設(shè)備。目的化合物可以是核酸、蛋白質(zhì)、分子、納米顆粒、藥物等或其任何組合。還提供了用噴墨打印裝置打印細(xì)胞的方法，其中至少一部分活細(xì)胞(優(yōu)選至少1％)被目的化合物轉(zhuǎn)染。優(yōu)選，至少25％的細(xì)胞在打印后是活的。此外，提供了形成活細(xì)胞的陣列的方法，其中至少一部分活打印細(xì)胞(優(yōu)選至少1％)被至少一種目的化合物轉(zhuǎn)染。
文檔編號C12N15/09GKCN101796186 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200880102309
公開日2013年5月22日 申請日期2008年6月6日
發(fā)明者徐弢, J·尤, A·阿塔拉 申請人:韋克福里斯特大學(xué)健康科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (4),