專利名稱:鳥(niǎo)類多能胚胎生殖細(xì)胞系的制作方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種制備已建立的鳥(niǎo)類多能胚胎生殖細(xì)胞系的方法和一種鳥(niǎo)類多能胚胎生殖細(xì)胞系。
近來(lái)，已經(jīng)將原生殖細(xì)胞(PGC)，性成熟后發(fā)育的精細(xì)胞或卵細(xì)胞的祖細(xì)胞，作為多能干細(xì)胞的另一來(lái)源。來(lái)源于PGC的干細(xì)胞被稱為胚胎生殖(EG)細(xì)胞(Resnick，J.L.等，自然，359，550-551(1992)；Matsui，Y.等，細(xì)胞，70，841-847(1992))。小鼠PGC已經(jīng)成功地與有絲分裂激活的STO細(xì)胞在提供三種重要生長(zhǎng)因子干細(xì)胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的條件下共培養(yǎng)(Godin，J.R.等，Mol.Reprod.Dev.，36，130-138(1991)；Dolci，S.等，自然，352，809-811(1991)；Matsui，Y.等，自然，353，750-752(1991)；Resnick，J.L.等，自然，359，550-551(1992))。Resnick等報(bào)道，小鼠PGC傳代培養(yǎng)后持續(xù)增殖，并形成類似ES細(xì)胞的細(xì)胞集落(Resnick，J.L.等，自然，359，550-551(1992))。Labosky等證明鼠EG細(xì)胞系具有體內(nèi)種系傳遞必需的多能性(Labosky，P.A.等，Development，120，3197-3204(1994))。
牛和豬EG細(xì)胞存在某些特性，例如形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶活性、和胚狀體形成(Cherny，R.A.等，Reprod.Fertil.Dev.，6，569-575(1994)；Shim，H.等，Biol.Reprod.，57，1189-1095(1997)；Piedrahita，J.A.等，J.Reprod.Fertil.，52，245-254(1997))。然而，在這些物種中還未證實(shí)種系傳遞。
Pain等報(bào)道，從長(zhǎng)期培養(yǎng)的胚盤(pán)細(xì)胞得到具有多種形態(tài)發(fā)生潛能的鳥(niǎo)干細(xì)胞并在體外維持生長(zhǎng)。然而，以前未曾報(bào)道過(guò)在任何非-哺乳動(dòng)物物種中從PGC產(chǎn)生多能EG細(xì)胞。
在鳥(niǎo)類物種中，PGC首先發(fā)生于明區(qū)(生殖細(xì)胞半月體)的外胚層，然后在第4期，孵化后約18-19小時(shí)，遷移到內(nèi)胚層(Swift，C.H.，Am.J.Anat.，15，483-516(1914)；Hamburger，V.和Hamilton，H.L.，J.Morphol.，88，49-92(1951)；Eyal-Giladi，H.和Kochav，S.，Dev.Biol.，49，321-337(1976))。在10-12期，PGC從生殖細(xì)胞半月體移動(dòng)到血流中(Ando，Y.和Fujimoto，T.，Dev.Growth Differ.，25，345-32(1983)；Ukeshima，A.等，J.Electron.Microsc.，40，124-128(1991))，在血管系統(tǒng)中循環(huán)直到第17期(孵化后2.5天)，此時(shí)它們到達(dá)生殖脊區(qū)，最后它們?cè)谀抢餄饪s并建群(Nieuwkoop，P.D.和Sutasurya，L.A.，In Primordial Germ Cells in the chrodates，113-127(1979))。該遷移途徑和隨后的發(fā)育過(guò)程與哺乳動(dòng)物物種中相應(yīng)過(guò)程完全不同。
Allioli等報(bào)道從生殖腺分離出來(lái)的雞PGC在體外培養(yǎng)條件下能夠增殖幾天(Allioli，N.等，Dev.Biol.，165，30-37(1994))。Chang等將來(lái)自生殖腺的雞PGC在生殖脊的基質(zhì)細(xì)胞上培養(yǎng)了5天(Chang，I.等，Cell Biol.Int.，19，569-676(1995))。當(dāng)將這些培養(yǎng)的生殖腺PGC重新注射到受體胚胎中，它們具有遷移到生殖脊的能力。最近，Chang等通過(guò)注射體外培養(yǎng)5天的生殖腺PGC產(chǎn)生種系嵌合小雞(Chang，I.等，Cell Biol.Int.，21，495-499(1997))。
另外，PCT公開(kāi)號(hào)WO 99/06534公開(kāi)了一種建立EG細(xì)胞的方法，該方法通過(guò)在補(bǔ)加LIF、bFGF、SCF和IGF-I而不應(yīng)用飼喂層的培養(yǎng)基中培養(yǎng)從13-14期胚胎血流分離出的PGC實(shí)現(xiàn)。然而，從胚胎可獲得的血流PGC的量，即約100個(gè)細(xì)胞/胚胎，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于gPGC的量，即超過(guò)1000個(gè)細(xì)胞/胚胎，這使得難以從胚胎血液中分離血液PGC。而且，雖然培養(yǎng)PGC不應(yīng)用飼喂層，但它們粘附到培養(yǎng)容器的壁上，僅傳代3-4次后它們的形態(tài)即發(fā)生改變。因此，推測(cè)該方法建立的EG細(xì)胞可能已經(jīng)分化。而且，僅考察了EG細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，以證明其多能性，而沒(méi)有考察它們的其它特性，因此，不能確定是否真正建立了EG細(xì)胞。另外，參考文獻(xiàn)沒(méi)有指教或預(yù)期EG細(xì)胞是否具有體外和體內(nèi)分化能力，而該能力是一種已建立EG細(xì)胞的特性，而且也沒(méi)有指教或預(yù)期它們?cè)趲状蝹鞔笫欠襁B續(xù)增殖。
因此，一直需要建立一種連續(xù)多代傳遞外源基因的EG細(xì)胞系，由此能夠利用外源基因轉(zhuǎn)染和基因靶向生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種鳥(niǎo)類多能胚胎生殖細(xì)胞系。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種制備一種已建立的鳥(niǎo)胚胎生殖細(xì)胞系的方法，包括以下步驟(a)在補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)因子和分化抑制因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)從鳥(niǎo)胚胎生殖腺分離出的原生殖細(xì)胞(PGC)，以便獲得EG細(xì)胞集落；(b)在與步驟(a)相同的培養(yǎng)基中，應(yīng)用飼喂層培養(yǎng)EG細(xì)胞，直到EG細(xì)胞建群；和(c)提取并在與步驟(a)相同的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)EG細(xì)胞，以便建立EG細(xì)胞系。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種具有基本上與保藏登記號(hào)為KCLRF-BP-00026的生物材料相同特征的雞胚生殖細(xì)胞系。

圖1a和1b顯示了雞EG細(xì)胞集落在雞胚成纖維細(xì)胞上3次傳代后的形態(tài)學(xué)特征(圖1a標(biāo)尺，50μm；圖1b標(biāo)尺，25μm)；圖2顯示了4次傳代后形成的EG細(xì)胞集落的PAS反應(yīng)性。
圖3顯示了4次傳代后形成的EG細(xì)胞集落的抗-SSEA-1抗體篩選結(jié)果；圖4顯示了8次傳代后染色的EG細(xì)胞集落的增殖分析結(jié)果；圖5a顯示了雞EG細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)8天后形成的胚狀體；圖5b到5d，分別顯示了用抗肌動(dòng)蛋白、α-1-fectoprotein和S100對(duì)胚狀體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果；圖6a顯示了具有黑羽毛的典型朝鮮Ogol小雞；圖6b顯示了頸周和胸部具有白斑的體細(xì)胞嵌合小雞；圖7顯示了體細(xì)胞和種系嵌合型的PCR分析結(jié)果。
發(fā)明詳述本發(fā)明的建立鳥(niǎo)類胚胎生殖(EG)細(xì)胞系的方法從分離鳥(niǎo)類原生殖細(xì)胞(PGC)開(kāi)始。鳥(niǎo)類可以是火雞、小雞、鵪鶉、雉、鴨子。PGC可以從早期鳥(niǎo)類胚胎，即14-36期(孵化后50小時(shí)到10天)，優(yōu)選24-30期(孵化后4-6.5天)的胚胎生殖腺分離。例如，分離28期的白來(lái)杭雞的胚胎生殖腺，然后在胰蛋白酶-EDTA中解離生殖腺組織，得到含生殖腺原生殖細(xì)胞(gPGC)的懸浮液。然而，胚胎的發(fā)育期沒(méi)有限制，除非它破壞了本發(fā)明目的，胚胎的發(fā)育期可以按照PGC從中分離的鳥(niǎo)類品種或器官、組織和膜種類改變。
分離的PGC在37℃-42℃溫度范圍內(nèi)，在含5％CO2的大氣條件下，在含細(xì)胞生長(zhǎng)因子和分化抑制因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到EG細(xì)胞建群。培養(yǎng)基優(yōu)選DMEM(Dulbecco’s改進(jìn)的Eagle’s培養(yǎng)基；Gibco BRL cat#，10313-021)或其功能等同物。
用于本發(fā)明的細(xì)胞生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括干細(xì)胞因子(SCF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、白介素-11(IL-11)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)和它們的混合物。代表性的分化抑制因子是白血病抑制因子(LIF)。培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有哺乳動(dòng)物血清、鳥(niǎo)類血清、或選自丙酮酸鈉、谷氨酰胺、β-巰基乙醇和它們混合物的補(bǔ)加成分。
培養(yǎng)基優(yōu)選補(bǔ)加0.1-30％胎牛血清(FBS)、0.02-20％小雞血清、0.01-100mM丙酮酸鈉、0.02-200mM谷氨酰胺、0.55-5500μM β-巰基乙醇、0.05-500ng/ml SCF、0.1-1000單位/ml LIF、0.1-1000ng/ml bFGF、0.0004-4ng/ml IL-11和0.1-1000ng/ml IGF-1的DMEM。
將在培養(yǎng)基上形成的EG細(xì)胞集落分離成單獨(dú)EG細(xì)胞，例如，通過(guò)反復(fù)用吸管抽吸，提取EG細(xì)胞，懸浮于培養(yǎng)基，例如，上述培養(yǎng)基，然后在37℃-42℃下，在飼喂層上培養(yǎng)7-10天，直到表現(xiàn)EG細(xì)胞系形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞建群。作為飼喂層，可以使用鳥(niǎo)類胚胎成纖維細(xì)胞或其等同物，而有絲分裂活性的鳥(niǎo)類胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)或鳥(niǎo)類成纖維細(xì)胞是最優(yōu)選的。
得到的EG細(xì)胞以7-10天的間隔在與上面建立胚胎生殖細(xì)胞系同樣的培養(yǎng)基中傳代。由此建立的胚胎生殖細(xì)胞系通過(guò)反復(fù)傳代培養(yǎng)可以維持4個(gè)月以上。
本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的雞EG細(xì)胞系。
該雞EG細(xì)胞系集落的形態(tài)是多層的，對(duì)該集落有清楚的描繪。每個(gè)雞EG細(xì)胞由一個(gè)較大的細(xì)胞核和相對(duì)較小量的細(xì)胞質(zhì)組成，類似于鼠和豬ES細(xì)胞和EG細(xì)胞的各自形態(tài)(Wobus，A.M.等，Exp.Cell.Res.，152，212-2199(1984)；Matsui，Y.等細(xì)胞，70，841-847(1992)；Resnick，J.L.等，自然，359，550-551(1992)；Shim，H.等，Biol.Reprod.，57，1089-1095(1997)；Piedrahita，J.A.等，Biol.Reprod.，58，1321-1329(1998))。然而，雞EG細(xì)胞的形態(tài)學(xué)與小鼠EG或EG細(xì)胞的形態(tài)學(xué)存在細(xì)微差異，即雞EG細(xì)胞幾乎所有集落都是圓形的，并且其它物種中觀察到的顯著暗核仁在雞EG細(xì)胞中不能清楚地分辨。鳥(niǎo)類物種與哺乳動(dòng)物物種在生殖細(xì)胞的生理、發(fā)育和分化上不同，因此，雞EG細(xì)胞與小鼠EG細(xì)胞在形態(tài)、粘附特性、和其它特征方面存在差異。
雞EG細(xì)胞保持生殖腺PGC和未分化干細(xì)胞的特征。雞EG細(xì)胞表達(dá)SSEA-1抗原，在體外懸浮培養(yǎng)中成功地發(fā)育成胚狀體，該胚狀體又能分化成多種細(xì)胞形態(tài)。進(jìn)一步確定雞EG細(xì)胞增殖和分化成多種組織，包括在應(yīng)用雞的實(shí)驗(yàn)中的胚胎發(fā)育過(guò)程中的生殖腺，因此，它們?cè)隗w內(nèi)是多能的。
本發(fā)明建立的一種雞胚生殖細(xì)胞系按照布達(dá)佩斯條約關(guān)于國(guó)際認(rèn)可的用于專利程序的微生物保藏規(guī)定于1999年9月22日保藏于韓國(guó)細(xì)胞系研究基金會(huì)(KCLRF)(地址癌癥研究所，漢城國(guó)立大學(xué)醫(yī)學(xué)院，#28，Yongon-dong，Dhongno-gu，漢城，110-744，韓國(guó))，保藏號(hào)為KCLRF-BP-00026。
可以通過(guò)將EG細(xì)胞注射到卵細(xì)胞，優(yōu)選微量注射到生殖腔或其血管中制備體細(xì)胞或種系嵌合體。更優(yōu)選，可以將EG細(xì)胞微量注射到X期卵的生殖腔中，或微量注射到13-17期卵的血管中。
可以將所需外源基因通過(guò)電穿孔或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和導(dǎo)入本發(fā)明的雞EG細(xì)胞，可以將它們?cè)诤股氐呐囵B(yǎng)基中傳代培養(yǎng)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的雞EG細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的雞EG細(xì)胞系對(duì)于制備轉(zhuǎn)基因雞以及對(duì)于研究生殖細(xì)胞分化和基因組印記是有用的。
下面實(shí)施例意在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明而不是限制其范圍。
另外，下面給出的固體在固體混合物中、液體在液體中、和固體在液體中的百分比分別基于wt/wt，vol/vol和wt/vol，除非另有具體說(shuō)明。實(shí)施例1PGC的分離和用于制備雞EG細(xì)胞系的培養(yǎng)條件的建立(步驟1)PGC的分離從農(nóng)業(yè)和生命科學(xué)院，漢城國(guó)立大學(xué)得到的白來(lái)杭雞的受精卵在37.5℃和相對(duì)濕度60-70％條件下孵育5.5天(直到28期)。從28期的受精卵提取胚胎，用無(wú)鎂的磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)在100mm有蓋培養(yǎng)皿中清洗，以除去卵黃和血液。將胚胎轉(zhuǎn)移到涂布黑蠟的培養(yǎng)皿中，用鑷子從中分離胚胎生殖腺。生殖腺組織用0.25％胰蛋白酶-0.05％EDTA處理，使其解離成單獨(dú)的生殖腺原生殖細(xì)胞(gPGC)。將其加入含有10％FBS(胎牛血清，Gibco，USA)的DMEM(Dulbecco’s改進(jìn)的Eagle’s培養(yǎng)基，Gibco BRL，USA)中，以使胰蛋白酶-EDTA滅活，離心收獲gPGC。(步驟2)培養(yǎng)條件的建立EG(胚胎生殖)細(xì)胞培養(yǎng)基(即，DMEM)附加一種或多種選自干細(xì)胞因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)、和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的生長(zhǎng)因子。曾報(bào)道SCF、LIF、和bFGF是使PGC在小鼠中存活和增殖的重要生長(zhǎng)因子(Resnick，J.L.等，自然，359，550-551(1992)；Donovan，P.J.，Curr.Top.Dev.Biol.，29，189-225(1994))。除了這三種因子，還向培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)相關(guān)因子例如白介素-11(IL-11)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-1)。將步驟1中得到的gPGC懸浮于附加上述因子的多種混合物的培養(yǎng)基中，在37℃，含5％CO2的大氣條件下培養(yǎng)，直到EG細(xì)胞建群。
實(shí)驗(yàn)顯示，缺乏IL-11和IGF-1時(shí)，EG細(xì)胞不會(huì)建群。因此，IL-11和IGF-I對(duì)于雞EG細(xì)胞的存活和增殖是關(guān)鍵的。實(shí)施例2雞EG細(xì)胞的培養(yǎng)將實(shí)施例1得到的EG細(xì)胞接種于裝有由DMEM(Gibco，USA)附加10％FBS、2％雞血清(Gibco，USA)、1mM丙酮酸鈉、2mM L-谷氨酰胺、5.5×10-5M β-巰基乙醇、100μg/ml鏈霉素、100單位/ml青霉素、5ng/ml人干細(xì)胞因子(hSCF；Sigma，USA)、10單位/ml鼠白血病抑制因子(mLIF；Sigma，USA)、10ng/ml牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF；Sigma，USA)、0.04ng/ml人白介素-11(h-IL-11；Sigma，USA)、和10ng/ml人胰島素樣-生長(zhǎng)因子-I(IGF-I；Sigma，USA)組成的EG細(xì)胞培養(yǎng)基的24孔培養(yǎng)板中，在37℃、含5％CO2大氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，以制備沉積在生殖脊基質(zhì)細(xì)胞(GRSC)層上的EG細(xì)胞集落。用吸管輕柔抽吸從GRSC層分離雞EG細(xì)胞集落，200Xg離心5分鐘收獲。收獲的EG細(xì)胞懸浮于DMEM，然后與未有絲分裂靜止的雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEFs)一起分置于新鮮24-孔平板。在上述條件下，以7-10天的間隔傳代EG細(xì)胞集落。這些集落維持10代以上，反復(fù)繼代培養(yǎng)增殖4個(gè)月以上。
圖1a和1b顯示在雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)上的3代后的雞EG細(xì)胞集落(圖1a標(biāo)尺，50μm；圖1b標(biāo)尺，25μm)。雞EG細(xì)胞的形態(tài)于小鼠ES活EG細(xì)胞的形態(tài)略有不同。幾乎所有雞EG細(xì)胞集落均為圓形，與CEG飼喂層沒(méi)有牢固邊界。與小鼠ES或EG細(xì)胞比較而言，雞EG細(xì)胞不會(huì)緊密地堆積到一起；因此不難分辨?zhèn)€體成員細(xì)胞。集落的形態(tài)是多層的，其邊界輪廓清晰。雞EG細(xì)胞有一個(gè)較大的細(xì)胞核和相對(duì)較少量細(xì)胞質(zhì)組成，但其核仁不顯著。實(shí)施例3EG細(xì)胞的特征為了確定EG細(xì)胞的多能性是否具有多能細(xì)胞的特征性質(zhì)，考察了其是否存在糖原和SSEA-1表位，以及其堿性磷酸酶活性和體外增殖和分化的能力。
(1)高碘酸希夫(PAS)染色實(shí)施例2得到的4代后的EG細(xì)胞集落置于平板上在1％戊二醛溶液中固定5分鐘，用等體積磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗兩次。將EG細(xì)胞集落浸泡于高碘酸溶液(Sigma，USA)室溫保持5分鐘，然后用等體積PBS漂洗。然后將EG細(xì)胞集落浸泡于希夫溶液(Sigma，USA)室溫保持15分總，然后用等體積PBS漂洗兩次。在倒置顯微鏡下觀察得到的EG細(xì)胞集落。通過(guò)對(duì)細(xì)胞質(zhì)中糖原染色的PAS反應(yīng)可以容易地鑒定雞PGC(Meyer，D.B.，Dve.Biol.，10，154-190(1964))。如圖2所示，4代后的EG細(xì)胞可以被PAS染色，雖然染色相對(duì)較弱。
(2)抗-SSEA-1抗體的篩選SSEA-1表位是未分化鼠ES細(xì)胞的特征，其已被認(rèn)為是區(qū)別多能干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)(Solter，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，75，5565-5596(1978))。為了確定EG細(xì)胞的多能性是否具有多能細(xì)胞的特性，考察了EG細(xì)胞是否存在SSEA-1表位。
將實(shí)施例2得到的4代后的EG細(xì)胞集落在1％戊二醛溶液中5分鐘固定于平板上，用等體積PBS漂洗兩次。從Development Studies HybridomaBank(開(kāi)發(fā)研究雜交瘤庫(kù))，Iowa大學(xué)，USA購(gòu)買(mǎi)抗-SSEA-1單克隆抗體的腹水(MC-480；Solter，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，75，5565-5596(1978))，用PBS稀釋1000倍，加入EG細(xì)胞集落。將得到的EG細(xì)胞集落與抗生物素蛋白/生物素-結(jié)合的堿性磷酸酶(Vector Lab.，USA)反應(yīng)，然后與BCIP/NBT堿性磷酸酶底物(BCIP/NBT堿性磷酸酶底物試劑盒IV，Vector Lab.，USA)反應(yīng)。向其中加入10mM EDTA(pH 8.0)終止反應(yīng)。
如圖3所示，所有4代后的EG細(xì)胞對(duì)SSEA-1染色均為陽(yáng)性，表明雞EG細(xì)胞表達(dá)了SSEA-1表位。
(3)增殖分析實(shí)施例2得到的8代后的EG細(xì)胞集落在含溴脫氧尿苷(BrdU，一種腺苷類似物)的溶液中，在37℃保持1小時(shí)，用等體積PBS漂洗兩次。用細(xì)胞增殖分析試劑盒(Amersham，UK)染色得到的EG細(xì)胞集落，然后用PAS重復(fù)(1)的程序進(jìn)行復(fù)染。應(yīng)用任意抗-BrdU的單克隆抗體和過(guò)氧化酶/DAB系統(tǒng)(Amersham，UK)檢測(cè)含有合并的BrdU的EG細(xì)胞集落。
圖4顯示了8代后染色的EG細(xì)胞集落的增殖分析結(jié)果。如圖4所示，8代后的EG細(xì)胞是連續(xù)增殖的。
(4)堿性磷酸酶活性分析應(yīng)用堿性磷酸酶底物試劑盒IV(Vector Lab.，USA)測(cè)定實(shí)施例2得到的4代后的EG細(xì)胞集落的堿性磷酸酶活性。
結(jié)果表明EG細(xì)胞幾乎沒(méi)有堿性磷酸酶活性，在繼代培養(yǎng)中也沒(méi)有恢復(fù)該活性。
按照Swartz，W.J.，Anat.Rec.，202，379-385(1982)，鳥(niǎo)類PGC的堿性磷酸酶活性早在孵化后2天可以觀察到，但在PGC進(jìn)入生殖脊后就觀察不到了，這可能意味著生殖腺PGC以及從其傳代得到的EG細(xì)胞的堿性磷酸酶活性實(shí)際上已經(jīng)非常弱。
(5)體外分化盒免疫組織化學(xué)分析為了考察雞EG細(xì)胞是否會(huì)形成胚狀體，輕柔攪動(dòng)實(shí)施例2得到的4代后的EG細(xì)胞集落，并離心得到彼此分離的EG細(xì)胞。將EG細(xì)胞懸浮于無(wú)mLIF的EG細(xì)胞培養(yǎng)基，然后置于非粘附性細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)皿。每隔8天更換培養(yǎng)基一次，每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞的形態(tài)。
圖5a顯示懸浮培養(yǎng)8天后由雞EG細(xì)胞形成的胚狀體。
收集由此形成的胚狀體，然后分散于96-孔平板，進(jìn)一步粘附于其上并分化。應(yīng)用抗肌-特異性肌動(dòng)蛋白的抗體(Dako，USA)、內(nèi)胚層-特異性α-1-fectoprotein(Dako，USA)和外胚層-特異性S100(Dako，USA)，以及DAKO LSAB試劑盒和抗生物素蛋白/生物素-結(jié)合的過(guò)氧化酶系統(tǒng)(Dako，USA)對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。
圖5b到5d圖示說(shuō)明了分別應(yīng)用抗肌動(dòng)蛋白、α-1-fectoprotein和S100的抗體對(duì)胚狀體進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。如圖5b到5d所示，EG細(xì)胞能夠在體外分化成多種細(xì)胞類型，例如，內(nèi)胚層、中胚層和外胚層譜系。實(shí)施例4嵌合雞的制備用X期或13-17期的朝鮮Ogol雞胚胎(Eyal-Giladi，H.等，Dev Biol，49，321-337(1976))作為受體。在各朝鮮Ogol雞蛋的側(cè)面或尖端穿刺，形成一個(gè)小窗，然后取出殼膜。
將實(shí)施例2得到的3或4代后的EG細(xì)胞已103個(gè)細(xì)胞/μl的濃度懸浮于EG細(xì)胞培養(yǎng)基，然后用微量移液管將2μl懸浮液注射到雞蛋的生殖腔或血管中。注射CEF的雞蛋用作對(duì)照。各雞蛋的窗口用石蠟?zāi)し鈨纱?，然后，將雞蛋尖端朝下放置直到孵化。孵化的雞生長(zhǎng)3個(gè)月，得到體細(xì)胞嵌合雞。
對(duì)于胚胎操作的45個(gè)蛋，8個(gè)蛋被孵化，在這8只雞中，3只(37.5％)在外形上是嵌合的。在嵌合雞中，注射3代EG細(xì)胞的胚胎孵化出兩只白色斑點(diǎn)雞，注射4代的EG細(xì)胞的胚胎孵化出一只。3只雞的白斑范圍變化很大。對(duì)照雞沒(méi)有觀察到白色羽毛。
圖6a顯示了一對(duì)具有黑色羽毛的典型朝鮮Ogol雞；圖6b為頸周和胸部具有白斑的體細(xì)胞嵌合雞。白來(lái)杭雞的毛色是白色，因其顯性色素抑制基因(I/I)，朝鮮Ogol雞，由于其隱性色素基因?yàn)楹谏Ｒ虼?，上述結(jié)果表明白來(lái)杭雞的EG細(xì)胞能夠在受體朝鮮Ogol雞胚胎中在體內(nèi)分化，因此，EG細(xì)胞在體內(nèi)是多能的。為了驗(yàn)證雞的體細(xì)胞嵌合型，從孵化過(guò)程中死亡的5只雞的肌肉、心臟、肝臟和生殖腺利用酚抽提得到基因組DNA樣品，然后用具有SEQ ID NO1(正向引物)和SEQ ID NO2(反向引物)核苷酸序列的白來(lái)杭雞-特異性SCAR(序列特征性擴(kuò)增區(qū))引物進(jìn)行PCR分析。
用50-100ng基因組DNA、0.2mM各種dNTP、10mM KCl、1.5mMMgCl2、0.4pmol正向引物、0.4pmol反向引物和1單位Taq聚合酶的25μl溶液進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR程序?yàn)樵贒NA熱循環(huán)儀(Perkin ElmerCetus)中94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘和72℃延伸2分鐘，循環(huán)45次。產(chǎn)生的白來(lái)杭雞特異性DNA片段約3kb。圖7描繪了體細(xì)胞嵌合型的PCR分析結(jié)果泳道1、5、9、13和17為應(yīng)用肝DNA的PCR產(chǎn)物；泳道2、6、10、14和18為肌DNA；泳道3、7、11、15和19為心DNA；泳道4、8、12、16和20為生殖腺DNA；泳道21為朝鮮Ogol雞基因組DNA；泳道22為白來(lái)杭雞基因組DNA；泳道23無(wú)模版。如圖7所示，體細(xì)胞嵌合型在個(gè)體之間不同5只雞之一在所有組織樣品(肝臟、心臟、肌肉、和生殖腺)表現(xiàn)體細(xì)胞嵌合型。注射的EG細(xì)胞形成兩只孵化雞的生殖腺，和所有雞的心臟；兩只雞僅在心臟中表現(xiàn)體細(xì)胞嵌合型。這些結(jié)果顯示雞EG細(xì)胞可以在體內(nèi)分化并形成各種組織包括生殖腺。實(shí)施例5外源基因轉(zhuǎn)染PGC或EG細(xì)胞，及其篩選分別應(yīng)用電穿孔和脂質(zhì)體將報(bào)告基因(GFP或Lac Z)轉(zhuǎn)染到PGC或EG細(xì)胞中。應(yīng)用電穿孔基因的轉(zhuǎn)染效率約為80％，應(yīng)用脂質(zhì)體為30％。轉(zhuǎn)染后的PGC或EG細(xì)胞在含350μg/ml新霉素的DMEM培養(yǎng)基中傳代，以篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PGC或EG細(xì)胞。
雖然本發(fā)明就上面具體實(shí)施方式
進(jìn)行了描述，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修飾和改動(dòng)，它們也落在所附權(quán)利要求
限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
微生物國(guó)際保藏證明(譯文)
序列表<110>韓在容韓美藥品工業(yè)株式會(huì)社樸泰燮<120>鳥(niǎo)類多能胚胎生殖細(xì)胞系<130>PC91143/HMY<150>KR 1999-4860<151>1999-02-11<160>2<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>白來(lái)杭雞特異性SCAR引物(正向引物)<400>1aacgcgtaga gttgcaggga tcag<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>白來(lái)杭雞特異性SCAR引物(反向引物)<400>2aacgcgtaga tattcgagta cctt
權(quán)利要求
1.一種制備已建立的鳥(niǎo)類胚胎生殖(EG)細(xì)胞系的方法，包括以下步驟(a)在補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)因子和分化抑制因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)從鳥(niǎo)胚胎生殖腺分離出的原生殖細(xì)胞(PGC)，以便獲得EG細(xì)胞集落；(b)在與步驟(a)相同的培養(yǎng)基中，應(yīng)用飼喂層培養(yǎng)EG細(xì)胞，直到EG細(xì)胞建群；和(c)提取并在與步驟(a)相同的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)EG細(xì)胞，以便建立EG細(xì)胞系。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中鳥(niǎo)類胚胎生殖腺處于14至36期。
3.權(quán)利要求
2的方法，其中鳥(niǎo)類胚胎生殖腺處于24至30期。
4.權(quán)利要求
1的方法，其中鳥(niǎo)類品種是火雞、小雞、鵪鶉、雉或鴨子。
5.權(quán)利要求
1的方法，其中當(dāng)在步驟(a)中培養(yǎng)原生殖細(xì)胞時(shí)，使用一層生殖脊基質(zhì)細(xì)胞(GRSC)作為飼喂層。
6.權(quán)利要求
1的方法，其中生長(zhǎng)因子選自干細(xì)胞因子(SCF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、白介素-11(IL-11)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)和它們的混合物。
7.權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)基附加選自0.05-500ng/ml SCF、0.1-1000ng/ml bFGF、0.0004-4ng/ml IL-11、0.1-1000ng/ml IGF-1和它們混合物的生長(zhǎng)因子。
8.權(quán)利要求
1的方法，其中分化抑制因子是白血病抑制因子(LIF)。
9.權(quán)利要求
8的方法，其中LIF的量為0.1-1000單位/ml。
10.權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類血清。
11.權(quán)利要求
1的方法，其中培養(yǎng)基進(jìn)一步含有選自丙酮酸鈉、谷氨酰胺、β-巰基乙醇和它們混合物的補(bǔ)加成分。
12.權(quán)利要求
1的方法，其中飼喂層具有有絲分裂活性。
13.權(quán)利要求
1或12的方法，其中飼喂層是成纖維細(xì)胞或其等同物。
14.權(quán)利要求
13的方法，其中成纖維細(xì)胞是鳥(niǎo)類成纖維細(xì)胞或鳥(niǎo)類胚胎成纖維細(xì)胞。
15.權(quán)利要求
14的方法，其中鳥(niǎo)類品種是小雞。
16.一種按照權(quán)利要求
1的方法制備的鳥(niǎo)類胚胎生殖(EG)細(xì)胞系。
17.權(quán)利要求
16的鳥(niǎo)類EG細(xì)胞系，其可以通過(guò)反復(fù)繼代培養(yǎng)維持。
18.權(quán)利要求
16的鳥(niǎo)類EG細(xì)胞系，其表達(dá)SSEA-1抗原、形成胚狀體、并分化和形成多種組織。
19.權(quán)利要求
16的鳥(niǎo)類EG細(xì)胞系，其是具有與保藏號(hào)為KCLRF-BP-00026的雞胚生殖細(xì)胞系基本上相同特征的雞胚生殖細(xì)胞系。
20.一種制備體細(xì)胞或種系嵌合體的方法，包括將權(quán)利要求
16的鳥(niǎo)類EG細(xì)胞注射到卵細(xì)胞中。
21.權(quán)利要求
20的方法，其中將EG細(xì)胞注射到生殖腔或卵細(xì)胞的血管中。
22.權(quán)利要求
21的方法，其中將EG細(xì)胞注射到X期的卵細(xì)胞的生殖腔中。
23.權(quán)利要求
21的方法，其中將EG細(xì)胞注射到13至17期的卵細(xì)胞的血管中。
24.一種將外源基因轉(zhuǎn)染到EG細(xì)胞或PGC中的方法，特征在于應(yīng)用電穿孔或脂質(zhì)體。
25.一種篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EG細(xì)胞或PGC的方法，包括在含抗生素的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了外源基因的EG細(xì)胞。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備已建立的鳥(niǎo)類胚胎生殖細(xì)胞系的方法,包括以下步驟:(a)在補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)因子和分化抑制因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)從鳥(niǎo)胚胎生殖腺分離出的原生殖細(xì)胞(PGC),以獲得EG細(xì)胞集落;(b)在與步驟(a)相同的培養(yǎng)基中,應(yīng)用飼喂層培養(yǎng)EG細(xì)胞,直到EG細(xì)胞建群;和(c)提取并在與步驟(a)相同的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)EG細(xì)胞,以建立EG細(xì)胞系。
文檔編號(hào)C12N15/09GKCN1373798SQ00803553
公開(kāi)日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2000年2月11日
發(fā)明者韓在容, 樸泰燮 申請(qǐng)人:韓在容, 韓美藥品工業(yè)株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan