本發(fā)明涉及人類細(xì)胞分選刺激，特別涉及一種細(xì)胞分選刺激試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)：

1、外周血單個核細(xì)胞（pbmc）主要包括淋巴細(xì)胞（如t細(xì)胞、b細(xì)胞和nk細(xì)胞等）、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。通過分選刺激處理，可以獲取其中的nk細(xì)胞或t細(xì)胞等特定細(xì)胞。常規(guī)的分選刺激方法包括：磁珠或孔板上包埋抗體進(jìn)行分選，細(xì)胞培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子進(jìn)行刺激；或用放射等處理的細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行刺激；或直接不同時間段使用不同刺激的培養(yǎng)基進(jìn)行刺激。但以上分選刺激手段操作步驟均過于繁瑣，且刺激細(xì)胞的增殖速率較慢，刺激的細(xì)胞與不需要刺激的細(xì)胞混合在一起難以分離，導(dǎo)致目的細(xì)胞占比不夠高。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于公開了一種細(xì)胞分選刺激試劑盒及其使用方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的一個或多個技術(shù)問題，提供至少一種有益的選擇或創(chuàng)造條件。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、本發(fā)明第一方面在于提供一種細(xì)胞分選刺激試劑盒。

4、本發(fā)明第二方面在于提供本發(fā)明第一方面所述試劑盒的使用方法。

5、本發(fā)明第一方面所述試劑盒包括微載體和微載體消化液，所述微載體的原料包括生物高分子、分選抗體和細(xì)胞因子。所述微載體的主要原料為生物高分子，在制備所述微載體的過程中生物高分子內(nèi)部會自然形成多孔結(jié)構(gòu)，從而具備負(fù)載分選抗體和細(xì)胞因子的功能。所述分選抗體可有效結(jié)合pbmc中的目的細(xì)胞。所述細(xì)胞因子則能夠持續(xù)有效刺激結(jié)合在所述微載體上的目的細(xì)胞。所述微載體消化液能夠消化所述微載體，使被所述微載體捕獲的目的細(xì)胞得到釋放。

6、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述試劑盒還包括細(xì)胞濾網(wǎng)。

7、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述微載體是由生物高分子、分選抗體和細(xì)胞因子通過交聯(lián)劑制成的多孔球體。

8、進(jìn)一步，所述微載體的制備方法包括步驟：a）將生物高分子制成溶液，冷卻至室溫加入分選抗體、細(xì)胞因子和交聯(lián)劑混合均勻制成水相；b）將水相滴入磁力攪拌的油相中；c）將混合的水油相置于-20℃以下的環(huán)境中反應(yīng)；d）反應(yīng)完成后取出去除油相即得所述微載體。

9、混合有生物高分子、分選抗體、細(xì)胞因子和交聯(lián)劑的水相在油相中被包裹成液滴，當(dāng)?shù)蜏亟Y(jié)冰時水分子凝固膨脹，恢復(fù)室溫后水分子融化流失，使得所述微載體內(nèi)部產(chǎn)生孔洞。帶有多孔結(jié)構(gòu)的所述微載體具有比表面積大的優(yōu)勢，能夠更容易通過其搭載的分選抗體捕獲pbmc中的目的細(xì)胞。較低的冷凍溫度有助于水分子快速冷凝，保證所述微載體能夠形成合適的多孔結(jié)構(gòu)。若水油相冷凍溫度偏高，會使得水分子不能及時形成冰晶微粒就被膠聯(lián)凝固，導(dǎo)致所述微載體表面光滑，孔洞減少，比表面積降低。優(yōu)選地，水油相的冷凍條件在-80~-20℃的范圍內(nèi)能夠滿足一般生產(chǎn)、實驗要求。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述微載體的粒徑為50~100?μm。所述試劑盒中配套的細(xì)胞濾網(wǎng)孔徑略小于所述微載體的粒徑，使得用戶在分選過程中能夠較為方便地將未被所述微載體捕獲的雜細(xì)胞傾倒排除。

11、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述生物高分子選自膠原蛋白、明膠或果膠。進(jìn)一步優(yōu)選，所述膠原蛋白為重組人源膠原蛋白；所述明膠為動物源明膠；所述果膠為植物源果膠。

12、相應(yīng)地，當(dāng)所述生物高分子選用膠原蛋白或明膠時，所述微載體消化液選用膠原酶；當(dāng)所述生物高分子選自果膠時，所述微載體消化液選自果膠酶。

13、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述分選抗體選自cd16、cd56、cd3和cd28中的至少一種。cd16、cd56為捕獲nk細(xì)胞分選抗體，cd3、cd28為捕獲t細(xì)胞的分選抗體。

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞因子選自il-2和il-18中的至少一種。il-2可同時刺激nk細(xì)胞和t細(xì)胞生長，il-18能夠刺激nk細(xì)胞生長。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述交聯(lián)劑為京尼平。

16、本發(fā)明第二方面所述使用方法包括以下步驟：1）將所述微載體加入細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，離心去上清，加入完全培養(yǎng)基混合均勻，置于容器中；2）將全血分離的外周血單個核細(xì)胞用完全培養(yǎng)基混合均勻，注入步驟1）所述容器中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育；3）過濾，保留所述微載體，用完全培養(yǎng)基重懸后搖晃培養(yǎng)；4）培養(yǎng)達(dá)到預(yù)期時間后過濾，保留所述微載體，加入所述微載體消化液，待微載體被降解后加入完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，清洗重懸后離心去上清，即得分選刺激細(xì)胞。

17、微載體在培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)，增加了單個容器中細(xì)胞的表面積，可以提高目的細(xì)胞的培養(yǎng)密度。培養(yǎng)達(dá)到預(yù)期密度數(shù)量后，可以通過細(xì)胞濾網(wǎng)過濾掉懸浮未結(jié)合在所述微載體上的雜細(xì)胞，再通過消化液降解所述微載體釋放目的細(xì)胞，從而提高目的細(xì)胞的收獲占比。

18、在本發(fā)明的一些實施方式中，離心條件為480×g至520×g，離心時長為2~3分鐘。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述孵育是在37±1℃和5±0.1%二氧化碳濃度的條件下進(jìn)行。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述消化反應(yīng)是指所述微載體在37℃條件下浸泡于所述微載體消化液中；消化所需的時間為5~10分鐘。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

22、（1）通過所述微載體搭載所述分選抗體，使得所述微載體特異性識別結(jié)合目的細(xì)胞，后續(xù)只需簡單過濾即可有效去掉未結(jié)合在所述微載體上的雜細(xì)胞，從而培養(yǎng)初期就可以提高目的細(xì)胞的占比。

23、（2）所述微載體搭載特定的細(xì)胞因子可以使目的細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定受到刺激，相較于傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)刺激是極大的改進(jìn)。

24、（3）所述微載體在同體積培養(yǎng)液中相較于培養(yǎng)瓶具有更高的表面積比，可以極大的增加目的細(xì)胞培養(yǎng)密度。

25、（4）培養(yǎng)過程步驟更簡單，無需飼養(yǎng)層細(xì)胞，無需不定期調(diào)整更換不同培養(yǎng)基。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)胞分選刺激試劑盒，其特征在于，包括微載體和微載體消化液，所述微載體的原料包括生物高分子、分選抗體和細(xì)胞因子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，還包括細(xì)胞濾網(wǎng)；和/或，

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述微載體的制備方法包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述微載體的粒徑為50~100?μm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述生物高分子選自膠原蛋白、明膠或果膠。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述微載體消化液選自膠原酶或果膠酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述分選抗體選自cd16、cd56、cd3和cd28中的至少一種。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述細(xì)胞因子選自il-2和il-18中的至少一種。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述交聯(lián)劑為京尼平。

10.權(quán)利要求1至9任一項所述試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞分選刺激試劑盒及其使用方法。所述試劑盒包括微載體和微載體消化液，所述微載體的原料包括生物高分子、分選抗體和細(xì)胞因子。所述微載體的主要原料為生物高分子，在制備所述微載體的過程中生物高分子內(nèi)部會自然形成多孔結(jié)構(gòu)，從而具備負(fù)載分選抗體和細(xì)胞因子的功能。所述分選抗體可有效結(jié)合PBMC中的目的細(xì)胞。所述細(xì)胞因子則能夠持續(xù)有效刺激結(jié)合在所述微載體上的目的細(xì)胞。所述微載體消化液能夠消化所述微載體，使被所述微載體捕獲的目的細(xì)胞得到釋放。

技術(shù)研發(fā)人員：何志昂,姜維,吳慶軍,葉紫玲
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳市達(dá)科為生物工程有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2