本發(fā)明涉及微生物工程，更具體地涉及一種重組大腸桿菌菌種凍存液及其制備方法以及應用。

背景技術：

1、菌種資源是人類的寶貴資源，國內外研究機構對菌種保藏都給予極大的關注，菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有形狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。菌種保藏就是人工創(chuàng)造條件使菌種處于與外界隔絕的狀態(tài)。菌種保藏的原理是使微生物的代謝盡量降低，以減少變異，一般可通過限制營養(yǎng)、缺氧、干燥和低溫等各種方式，使菌種處于“半休眠”或“休眠”狀態(tài)，減少菌種的變異幾率和死亡概率，并保持良好的遺傳基因。

2、重組大腸桿菌為一種基因工程菌，含有由載體質粒等攜帶的外源dna片段，這些片段通常具有遺傳不穩(wěn)定性，在傳代過程中很容易丟失其外源質粒復制子，在菌種保藏和復壯階段也很容易因丟失外源質粒而直接影響基因工程菌種的相關性能。重組大腸桿菌的菌種保藏通常采用甘油管-80℃超低溫或液氮保藏的方式，甘油管-80℃超低溫保藏一段時間后菌種存活率顯著降低；液氮保藏的保存條件要求苛刻，不僅保藏初始費用較高，保藏過程中因液氮蒸發(fā)導致溫度上升，冰晶狀態(tài)發(fā)生變化而容易導致菌種死亡，所以需密切關注液氮殘存量，定期補加液氮，在補加時還存在因液氮暴露在空氣中會發(fā)生爆炸的危險，操作人員需具備較高的操作熟練度。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種重組大腸桿菌菌種凍存液及其制備方法以及應用，從而解決現(xiàn)有技術中重組大腸桿菌菌種保存時存在的存活率降低、保存條件要求苛刻、費用較高的問題。

2、為了解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案具體如下：

3、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種重組大腸桿菌菌種凍存液，所述重組大腸桿菌菌種凍存液的配方為：甘油200~500g/l、蔗糖20~100g/l、脫脂奶粉20~50g/l，bsa?1~5g/l、氯化鈉4~8g/l，維生素c?1~5g/l。

4、優(yōu)選地，所述重組大腸桿菌菌種凍存液的配方為：甘油200~400g/l、蔗糖50~100g/l、脫脂奶粉20g/l，bsa?1~5g/l、氯化鈉4.5~7.2g/l，維生素c?1~2g/l。

5、根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，所述重組大腸桿菌菌種凍存液的配方為：甘油200g/l、蔗糖50g/l、脫脂奶粉20g/l，bsa?5g/l、氯化鈉7.2g/l，維生素c?2g/l。該配方為本發(fā)明的最優(yōu)選方案。采用該配方的重組大腸桿菌菌種凍存液對重組大腸桿菌菌種的保護效果最佳。

6、根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選方案，所述重組大腸桿菌菌種凍存液的配方為：甘油200g/l、蔗糖50g/l、脫脂奶粉20g/l，bsa?2g/l、氯化鈉7.2g/l，維生素c?1g/l。

7、根據(jù)本發(fā)明的又一優(yōu)選方案，所述重組大腸桿菌菌種凍存液的配方為：甘油200g/l、蔗糖50g/l、脫脂奶粉20g/l，bsa?1g/l、氯化鈉7.2g/l，維生素c?2g/l。

8、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種重組大腸桿菌菌種凍存液的制備方法，包括以下步驟：a1：分別稱取甘油200~500g、蔗糖20~100g、氯化鈉4~8g，依次加入蒸餾水中，攪拌至基本溶解后用純水定容至1l；a2：115℃高溫滅菌15~30min，冷卻至室溫備用；a3：分別稱取脫脂奶粉20~50g、bsa?1~5g、維生素c?1~5g，依次加入上述溶液，攪拌至溶解后使用0.22μm濾膜過濾除菌，隨后于2~8℃保存?zhèn)溆没蛑糜?20℃以下長期保存。

9、根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種重組大腸桿菌菌種凍存方法，包括以下步驟：b1：制備一種如上面所述的重組大腸桿菌菌種凍存液；b2：取目的質粒dna?100ng加入50μl大腸桿菌(e.?coli)?bl21?(de3)感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后冰浴20min，置于42℃水浴中45s，迅速轉移至冰浴2?min，加入800μllb液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)45min后接種到含amp的lb固體平板上，將平板倒置入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h；b3：采用抗生素濃度為100?μg/ml的lb培養(yǎng)基進行重組大腸桿菌菌種的培養(yǎng)，挑取單克隆菌落至lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm恒溫培養(yǎng)6~8h，采用革蘭氏染色法進行鏡檢，若發(fā)生污染則立即停止培養(yǎng)；采用吸光度法對菌種活力進行檢測，達到所要求的od600值在0.8~2.0時停止培養(yǎng)；b4：按1:1的體積比依次抽取步驟b1的重組大腸桿菌菌種凍存液和步驟b2的菌液加入到凍存管中，蓋緊凍存管瓶蓋，上下翻轉，使其充分混勻；將獲得的菌種包裝貼上標簽置于-20℃~-196℃長期保存。

10、為克服現(xiàn)有技術中存在的重組大腸桿菌菌種存活率降低、保存條件苛刻、費用較高的問題，有必要開發(fā)一種新的菌種保藏方法。發(fā)明人嘗試在甘油管凍存菌種基礎上進一步優(yōu)化，輔以多種保護劑開發(fā)出一種新型凍存液。然而重組大腸桿菌菌種在冷凍、儲存和復蘇過程中，存在著多種誘導菌種死亡、外源質粒丟失、菌種活率下降的因素，此外菌種懸液的濃度、菌種材料的菌齡、培養(yǎng)基的種類、保護劑等較多因素也會影響菌種的冷凍保藏，因此需根據(jù)菌種的特性選選擇合適種類及數(shù)量的保護劑，才能保證菌種的長期穩(wěn)定存儲與生產(chǎn)應用。因此，研究開發(fā)出一種適用于重組大腸桿菌菌種保藏的操作方法簡單、條件溫和、并可保證菌種性能穩(wěn)定、實現(xiàn)長期保存的保藏方法，對于基因工程菌優(yōu)良性能的保持、復制和延續(xù)具有重大的現(xiàn)實意義，更有利于工業(yè)化穩(wěn)定生產(chǎn)。

11、現(xiàn)有技術中使用的冷凍保護劑成分一般選用甘油和某些多元醇類化合物如甘露醇等，也有一些冷凍保護劑選用二甲基亞砜。甘油和多元醇的主要作用是使水不易結冰，二甲基亞砜能夠降低細胞的冰點，減少冰晶的形成，減少自由基對其細胞的損害，改變生物膜對電解質和代謝產(chǎn)物的通透性，但是二甲基亞砜在常溫下對細胞有較強的毒性作用。

12、本發(fā)明提供了一種新的以甘油為主體的重組大腸桿菌菌種凍存液，在選擇配方時考慮到重組大腸桿菌在凍存過程中受到的多重因素的影響，選擇了不同機理的保護劑進行加強或協(xié)同保護菌種。

13、其中，甘油的功效是使凍結的過程延長，因為甘油不會進入冰中，所以隨著結凍的進行，甘油的濃度是增加的，進而進一步降低冰點。由于凍結比較緩慢，所以水的靜壓力可能分布的更加均勻，同時菌也可能相對于環(huán)境先行凍結，這些都有利于它們的存活。甘油也會對細胞膜形成保護。通常的凍存的問題在于，細胞中形成的冰晶有可能會損壞脆弱的細胞膜結構，這樣在解凍后細胞就不能正常的存活了。而甘油或許可以增加脂雙分子層的延展性，從而保護了細胞的膜結構。

14、蔗糖是一種非滲透性糖，可以增加凍存液的滲透壓，有助于細胞保持水分平衡，此外蔗糖還能夠抑制細胞組織內冰晶形成、保護質膜及蛋白質結構完整性等作用。

15、加入生理水平的氯化鈉能降低甘油的高滲作用，能夠更好的保護菌種。

16、高分子保護劑脫脂奶粉是一個混合物，包含了蛋白質、鹽類和維生素等多種物質，其蛋白質為菌種細胞提供一個保護性外膜，其中的磷酸鹽和檸檬酸鹽可以起到緩沖作用，穩(wěn)定ph值。

17、牛血清白蛋白（bsa）在低溫環(huán)境下對酶、細胞膜和整個細胞提供保護作用，同時也具有一定抗氧化活性，從而能夠更好的保護菌種。

18、維生素c作為抗氧化劑，能夠避免菌種在凍結和貯藏中受到的氧化損傷，提高菌種存活率和穩(wěn)定性。維生素c作為一種抗氧化劑，通過與氧氣形成自由基消除相應的細胞膜氧化損傷，同時維生素c還可以通過防止α-氨基或賴氨酸、半胱氨酸或組氨酸殘基的羰基化來防止對重要細菌成分如蛋白質和dna的氧化損傷，增強了菌種的存活率和儲藏性。

19、本發(fā)明的發(fā)明點主要在于，提供這樣一種重組大腸桿菌菌種凍存液配方。大腸桿菌凍存時大多使用50%甘油凍存法、脫脂奶粉凍存法進行凍存。其中，50%甘油凍存法由于甘油濃度較高會降低重組大腸桿菌的質粒穩(wěn)定性，進而影響重組菌表達穩(wěn)定性；脫脂奶粉凍存法則成本較高，在大腸桿菌凍存中應用相對較少。根據(jù)本發(fā)明提供的這樣一種重組大腸桿菌菌種凍存液，一方面通過降低甘油濃度以增強菌種的質粒穩(wěn)定性，另一方面采用蔗糖、脫脂奶粉輔助甘油增強凍存保護效果，并添加氯化鈉平衡滲透壓，同時，還通過添加bsa和維生素c進一步降低了凍存和復蘇過程中的氧化損傷。本發(fā)明提供這樣一種新的以甘油為主體的重組大腸桿菌菌種凍存液，在選擇配方時考慮到重組大腸桿菌在凍存過程中受到的多重因素的影響，選擇了不同機理的保護劑進行加強或協(xié)同保護菌種。

20、本發(fā)明的另一發(fā)明點還在于，通過對配方的不斷優(yōu)化，最終得到多種優(yōu)選的重組大腸桿菌菌種凍存液配方。其中，最優(yōu)選的一種重組大腸桿菌菌種凍存液的配方為：甘油200g/l、蔗糖50g/l、脫脂奶粉20g/l，bsa?5g/l、氯化鈉7.2g/l，維生素c?2g/l，采用該配方的重組大腸桿菌菌種凍存液對重組大腸桿菌菌種的保護效果最佳，優(yōu)于其他所有凍存液。

21、本發(fā)明采用該凍存液成分用于保存菌種效果較好，使用本發(fā)明所述凍存液及保藏方法凍存重組大腸桿菌質量穩(wěn)定，凍存方法簡單，凍存范圍廣（-20℃~-196℃），菌種保藏時間長，可以在-80℃下保藏3年以上，并且經(jīng)保藏后的菌種在復蘇時具有高活性，保藏過程簡單，便于儲存與查找。該方法具有操作簡單實用、保藏時間長、菌種質量穩(wěn)定可靠、保藏成本低的優(yōu)點。本發(fā)明的方法保藏的重組大腸桿菌菌種通過復蘇菌種并傳四代培養(yǎng)后檢測表達量，誘導2h的蛋白表達量較高。

22、綜上所述，本發(fā)明提供了一種能夠更好地保護重組大腸桿菌菌株、并且保藏時間長的重組大腸桿菌菌種凍存液，還提供了一種操作簡單實用、保藏時間長、菌種質量穩(wěn)定可靠、保藏成本低的重組大腸桿菌菌種保藏方法。