本發(fā)明涉及生物技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)，尤其是指一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)作為一種在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性、干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)等方面與胚胎干細(xì)胞(esc)高度相似的人工誘導(dǎo)干細(xì)胞，其在dna甲基化模式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)以及形成嵌合體動(dòng)物等方面也幾乎完全一致。

2、ipsc所具備的強(qiáng)大自我更新能力和多向分化潛能,能夠在體外分化為人體幾乎所有210種細(xì)胞類型,為疾病治療帶來(lái)了廣泛的前景。與esc相比，利用ipsc進(jìn)行組織或器官移植可以避免自身免疫系統(tǒng)的排斥,同時(shí)也避免了esc所面臨的倫理爭(zhēng)議。因此，ipsc成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的重要干細(xì)胞來(lái)源。

3、干細(xì)胞技術(shù)的突破性發(fā)展,將改變未來(lái)的醫(yī)療方式。不再局限于化學(xué)合成藥物,而是利用具有生物活性的小分子蛋白、抗體或干細(xì)胞等,針對(duì)性地將其送入體內(nèi)以實(shí)現(xiàn)疾病治療。特別是在2012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了成功將成年細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為ipsc的日本科學(xué)家山中伸彌,這極大地推動(dòng)了ipsc技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛應(yīng)用前景。目前已有9種適應(yīng)癥進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,包括眼角膜移植、帕金森氏癥、視網(wǎng)膜黃斑病變、心臟疾病、脊髓疾病、輸血性疾病、關(guān)節(jié)炎、糖尿病和腫瘤相關(guān)疾病等。

4、我國(guó)也已有相關(guān)ipsc來(lái)源心肌細(xì)胞產(chǎn)品獲得臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)，采用ipsc分化而來(lái)的心肌細(xì)胞,通過(guò)靜脈注射應(yīng)用于治療嚴(yán)重慢性缺血性心力衰竭。與傳統(tǒng)治療手段相比,該方法不僅更加安全,還能顯著改善患者心功能和生活質(zhì)量。此外,化學(xué)誘導(dǎo)法進(jìn)一步豐富了體細(xì)胞"重編程"技術(shù)。利用特定化學(xué)小分子,可促進(jìn)體細(xì)胞重塑為多能干細(xì)胞,并進(jìn)一步分化為所需細(xì)胞類型,如心肌細(xì)胞。該方法操作簡(jiǎn)便、效率高,且無(wú)需基因編輯,避免了相關(guān)倫理爭(zhēng)議。更重要的是,利用患者自體細(xì)胞制備的ipsc衍生細(xì)胞移植,可規(guī)避免疫排斥反應(yīng),提高治療的安全性和有效性。

5、總的來(lái)說(shuō),ipsc分化心肌細(xì)胞在心力衰竭治療中展現(xiàn)出廣闊應(yīng)用前景，但目前相關(guān)研究還不夠充分,可選替代產(chǎn)品尚不成熟,仍需進(jìn)一步研發(fā)和臨床驗(yàn)證；現(xiàn)有技術(shù)中的誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，未通過(guò)分階段培養(yǎng)的方式，實(shí)現(xiàn)ipsc定向分化心肌細(xì)胞的目的，未采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑呐囵B(yǎng)基配方，有效使得ipsc分化為心肌細(xì)胞，并表達(dá)相應(yīng)基因標(biāo)志物；因此，針對(duì)此現(xiàn)狀，迫切需要開發(fā)一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，以滿足實(shí)際使用的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在之缺失，其主要目的是提供一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，通過(guò)分階段培養(yǎng)的方式，實(shí)現(xiàn)了ipsc定向分化心肌細(xì)胞的目的，使用新的培養(yǎng)基配方，提供了新的干細(xì)胞分化和定向培養(yǎng)的思路和方法，有效使得ipsc分化為心肌細(xì)胞，并表達(dá)相應(yīng)基因標(biāo)志物。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下之技術(shù)方案：

3、一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

4、s1、預(yù)處理：對(duì)培養(yǎng)容器的培養(yǎng)界面進(jìn)行處理，使用特定基質(zhì)或蛋白進(jìn)行包被處理；

5、s2、ipsc接種：按特定細(xì)胞懸液濃度種入經(jīng)預(yù)處理的培養(yǎng)容器中，等待細(xì)胞貼壁，此階段使用的培養(yǎng)基為ipsc培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為1-3天；

6、s3、第一誘導(dǎo)分化階段：將步驟s2階段的全部培養(yǎng)基棄去，加入適量的第一階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基，處理2-3天，期間不換液；

7、s4、第二誘導(dǎo)分化階段：將步驟s3階段的全部培養(yǎng)基棄去，加入適量的第二階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基，處理10天，其中，每2天全換液一次，第八天開始加入um171至第10天收獲細(xì)胞。

8、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s3中所用的第一階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括stem34pro培養(yǎng)基和第一因子添加劑，該第一因子添加劑為：5-30ng/ml的vegf、5-30ng/ml的scf、3-10nm的a83-01、2-10nm的brd5648、5-30ng/ml的bmp4和2nm的谷氨酰胺。

9、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s4中所用的第二階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括stem34pro培養(yǎng)基和第二因子添加劑，該第二因子添加劑為：25-60ng/ml的vegf、25-60ng/ml的scf、25-60ng/ml的flt-3、5-30ng/ml的tpo、5-30ng/ml的il-3、5-30ng/ml的gm-scf、75-120ng/ml的um171、20-100nm的ldn-212854。

10、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s1中，特定基質(zhì)或蛋白包括matrigel、胎盤脫細(xì)胞基質(zhì)、laminin-521蛋白和fibronectin中的一種或多種組合。

11、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s1中，特定基質(zhì)或蛋白包括濃度為3μg/ml的laminin-521蛋白和濃度為2μg/ml的fibronectin。

12、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中ipsc接種過(guò)程中，采用的細(xì)胞懸液濃度為20000-80000個(gè)/ml。

13、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中采用的細(xì)胞懸液濃度為50000個(gè)/ml；該步驟s2中所使用的ipsc培養(yǎng)基為e8培養(yǎng)基或mtser培養(yǎng)基。

14、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s4中第二誘導(dǎo)分化階段，收獲細(xì)胞的方式為：使用d-pbs緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行輕柔的清洗，加入適量的accutase消化2min使細(xì)胞解離，收集消化后的細(xì)胞懸液，離心，收集細(xì)胞沉淀，獲得心肌細(xì)胞。

15、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s1中預(yù)處理具體為：使用不含ca2+、mg2+離子的pbs溶液對(duì)培養(yǎng)容器進(jìn)行潤(rùn)洗，棄去潤(rùn)洗液后，按3μg/ml的laminin-521和2μg/ml的fibronectin加入培養(yǎng)容器中，然后放于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中包被至少1小時(shí)備用。

16、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s2中ipsc接種前進(jìn)行ipsc復(fù)蘇：將ipsc從深低溫環(huán)境中取出，于37℃快速?gòu)?fù)溫解凍，使用d-pbs于200g離心持續(xù)3-5分鐘。

17、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)和有益效果，具體而言，由上述技術(shù)方案可知，通過(guò)采用本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊环N誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，通過(guò)分階段培養(yǎng)的方式，實(shí)現(xiàn)了ipsc定向分化心肌細(xì)胞的目的，該方法相比現(xiàn)有技術(shù)，使用新的培養(yǎng)基配方，提供了新的干細(xì)胞分化和定向培養(yǎng)的思路和方法；本申請(qǐng)構(gòu)建了一套完整的制備心肌細(xì)胞的方法，操作便捷，實(shí)用性強(qiáng)；本申請(qǐng)明確了在該種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法下，有效使得ipsc分化為心肌細(xì)胞，并表達(dá)相應(yīng)基因標(biāo)志物。

18、為更清楚地闡述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征和功效，下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例來(lái)對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

技術(shù)特征：

1.一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s3中所用的第一階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括stem34pro培養(yǎng)基和第一因子添加劑，該第一因子添加劑為：5-30ng/ml的vegf、5-30ng/ml的scf、3-10nm的a83-01、2-10nm的brd5648、5-30ng/ml的bmp4和2nm的谷氨酰胺。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s4中所用的第二階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括stem34pro培養(yǎng)基和第二因子添加劑，該第二因子添加劑為：25-60ng/ml的vegf、25-60ng/ml的scf、25-60ng/ml的flt-3、5-30ng/ml的tpo、5-30ng/ml的il-3、5-30ng/ml的gm-scf、75-120ng/ml的um171、20-100nm的ldn-212854。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s1中，特定基質(zhì)或蛋白包括matrigel、胎盤脫細(xì)胞基質(zhì)、laminin-521蛋白和fibronectin中的一種或多種組合。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s1中，特定基質(zhì)或蛋白包括濃度為3μg/ml的laminin-521蛋白和濃度為2μg/ml的fibronectin。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s2中ipsc接種過(guò)程中，采用的細(xì)胞懸液濃度為20000-80000個(gè)/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s2中采用的細(xì)胞懸液濃度為50000個(gè)/ml；該步驟s2中所使用的ipsc培養(yǎng)基為e8培養(yǎng)基或mtser培養(yǎng)基。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s4中第二誘導(dǎo)分化階段，收獲細(xì)胞的方式為：使用d-pbs緩沖液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行輕柔的清洗，加入適量的accutase消化2min使細(xì)胞解離，收集消化后的細(xì)胞懸液，離心，收集細(xì)胞沉淀，獲得心肌細(xì)胞。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s1中預(yù)處理具體為：使用不含ca2+、mg2+離子的pbs溶液對(duì)培養(yǎng)容器進(jìn)行潤(rùn)洗，棄去潤(rùn)洗液后，按3μg/ml的laminin-521和2μg/ml的fibronectin加入培養(yǎng)容器中，然后放于含5％co2的37℃培養(yǎng)箱中包被至少1小時(shí)備用。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，其特征在于：所述步驟s2中ipsc接種前進(jìn)行ipsc復(fù)蘇：將ipsc從深低溫環(huán)境中取出，于37℃快速?gòu)?fù)溫解凍，使用d-pbs于200g離心持續(xù)3-5分鐘。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法，涉及生物技術(shù)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，該種誘導(dǎo)分化制備心肌細(xì)胞的方法包括如下步驟：S1、預(yù)處理：對(duì)培養(yǎng)容器的培養(yǎng)界面進(jìn)行處理，使用特定基質(zhì)或蛋白進(jìn)行包被處理；S2、iPSC接種：按特定細(xì)胞懸液濃度種入經(jīng)預(yù)處理的培養(yǎng)容器中，等待細(xì)胞貼壁；S3、第一誘導(dǎo)分化階段：將步驟S2階段的全部培養(yǎng)基棄去，加入適量的第一階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理；S4、第二誘導(dǎo)分化階段：加入適量的第二階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基，處理并收獲細(xì)胞；通過(guò)分階段培養(yǎng)的方式，實(shí)現(xiàn)了iPSC定向分化心肌細(xì)胞的目的，使用新的培養(yǎng)基配方，提供了新的干細(xì)胞分化和定向培養(yǎng)的思路和方法，有效使得iPSC分化為心肌細(xì)胞，并表達(dá)相應(yīng)基因標(biāo)志物。

技術(shù)研發(fā)人員：蔡車國(guó),傅澤欽,郭艷秋,胡樾,王玉霞,李夢(mèng)園,胡雋源
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳市北科生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9