本發(fā)明涉及一種西尼羅病毒數(shù)字pcr檢測方法，屬于分子生物學檢測。

背景技術(shù)：

1、西尼羅熱(west?nile?fever)是由西尼羅病毒(west?nile?virus，wnv)引起的通過蚊蟲傳播的人畜共患病，屬于黃病毒科黃病毒屬(smithburn?et?al.,1940)。wnv在蚊蟲及鳥類中完成傳播，對于美洲烏鴉和藍鴉以外大部分鳥類來說，感染西尼羅病毒并沒有明顯癥狀。在馬中會出現(xiàn)肌無力、共濟失調(diào)等體征，有的馬也會表現(xiàn)出肌肉震顫和顱神經(jīng)損傷。在人類中絕大部分為隱性感染，少數(shù)人會出現(xiàn)頭疼、發(fā)熱和嘔吐等類似感冒的癥狀，只有極少數(shù)人感染后會出現(xiàn)病毒性腦炎及腦膜炎癥狀。近期越來越多的數(shù)據(jù)表明該病毒的感染范圍急劇擴大，研制出快速準確的wnv檢測方法迫在眉睫。

2、目前wnv實驗室檢測方法包括分子生物學檢測、抗原檢測及血清學檢測三類。血清學方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、病毒中和試驗(vn)、斑塊減少中和試驗(prn)等，分子生物學檢測方法主要包括巢式rt-pcr(nested?rt-pcr)、實時熒光定量pcr(real?timert-qpcr)和數(shù)字pcr(digital?pcr，dpcr)等，抗原測是通過免疫組織化學染色法(immunohistochemical?staining，ihc)對染病組織處理完成的檢測。

3、傳統(tǒng)pcr方法及rt-pcr方法操作比較簡便，但受限于模板濃度，當模板濃度過低時，檢測結(jié)果準確率較低。而血清學檢測方法對血樣的新鮮程度有較高要求，實驗操作也相對繁瑣，對實驗人員技能水平要求較高。

4、免疫組化試驗僅能檢測動物組織，檢測的敏感性、特異性與所選取的抗體關(guān)系密切，檢測結(jié)果假陰性率較高。數(shù)字pcr是一種新興的核酸檢測絕對定量的技術(shù)，與rt-qpcr相比，有特異性強，靈敏度高，重復性好的特點，該技術(shù)已在醫(yī)藥研制、疫病篩查、食品安全等領(lǐng)域得到應用。

5、中國專利cn202410114678.6公開了一種非洲馬瘟和西尼羅病毒的雙重實時熒光mira檢測引物探針組、試劑盒及方法；可以鑒別出所有種型的ahsv與wnv。該發(fā)明對于兩種病原檢測的靈敏度均為102copies/μl。具有特異性強、反應時間短的特點，非常適用于非洲馬瘟和西尼羅病毒的現(xiàn)場快速診斷。

6、中國專利cn202210521965公開了一種西尼羅病毒核酸檢測引物探針組合物及一體化微流控芯片試劑盒；采用該發(fā)明提供的引物探針組合物檢測西尼羅病毒，具有較好的靈敏度和準確度，擴增效率高，且操作簡便，快速省時。利用一體化芯片上微流控的方式集成了核酸提取、純化、擴增和檢測，解決病原體快速檢測的問題，實現(xiàn)“樣本進-結(jié)果出”的poct檢測方案，取樣后直接加入設(shè)備，純化加擴增，60分鐘內(nèi)出結(jié)果

7、數(shù)字pcr是20世紀90年代興起的核酸檢測絕對定量的技術(shù)，與rt-qpcr相比，有特異性強，靈敏度高，重復性好的特點，特點是在極低濃度核酸檢測方面有著絕對的優(yōu)勢，且其讀數(shù)精確，可直接判讀檢測溶液所含目的基因的濃度，該技術(shù)已在醫(yī)藥研制、疫病篩查、食品安全等領(lǐng)域得到應用。數(shù)字pcr作為新的絕對定量檢測技術(shù)，理論上可完成單個病毒核酸的檢測，從而有效避免了rt-pcr方法及elisa方法中中對結(jié)果有效性及特異性的懷疑。

8、現(xiàn)有技術(shù)中還未有數(shù)字pcr檢測西尼羅病毒的報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種重復性好、靈敏度高、特異性好的西尼羅病毒(west?nile?virus，wnv)檢測方法。具體的，本發(fā)明在熒光定量pcr的基礎(chǔ)上建立、優(yōu)化和驗證了可用于精準檢測wnv的數(shù)字pcr方法。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、首先，本發(fā)明以wnv保守區(qū)域ns2a序列為模板，設(shè)計引物和探針，具體序列序列如seq?id?no：1-4所示，具體如下：

4、

5、本發(fā)明還提供一種檢測西尼羅病毒的試劑盒，所述的引物和探針。既利用上述設(shè)計的引物和探針，制備檢測西尼羅病毒的試劑盒。

6、利用上述提供的試劑盒，可以用在檢測西尼羅病毒。

7、本發(fā)明還提供一種西尼羅病毒的數(shù)字pcr檢測方法，檢測方法的體系及程序如下：

8、配置體系：supermix(bio?rad)5μl，reversetranscriptase?2μl，上下游引物(10μmol/l)各1.8μl(終濃度0.9μmol/l)，探針(10μmol/l)0.5μl(終濃度0.25μmol/l)，模板1μl，加水補至20μl；

9、將20μl反應液轉(zhuǎn)移至微滴生成卡槽中，同時，在下孔中加入70μl微滴生成油，蓋上檔條后放入微滴生成儀中生成微滴；隨后轉(zhuǎn)移40μl微滴至96孔pcr板中，加熱封膜后置于pcr儀中，反應條件為：42℃60min，95℃10min；95℃30s；60℃1min，擴增40個循環(huán)；98℃10min，擴增完畢，使用微滴讀取儀讀取微滴熒光信號，并在軟件中分析結(jié)果。

10、優(yōu)選的，檢測方法用的退火溫度為60℃。

11、本發(fā)明的有益效果：

12、本發(fā)明以wnv保守區(qū)域ns2a序列為模板，設(shè)計引物探針，建立了一種重復性好、靈敏度高、特異性好的西尼羅病毒(west?nile?virus，wnv)檢測方法，檢測結(jié)果顯示本方法在引物終濃度900nm、探針濃度250nm、退火溫度為60℃時效率最高。同時該方法特異性較好，對弓形蟲病(tox)、布魯氏菌(brf)、禽流感病毒(aiv)、h3n8馬流感病毒、尼帕病毒(niv)、馬流感病毒(ehv)、馬動脈炎病毒(eav)等家禽、家畜疾病無交叉反應，對wnv病毒的檢測靈敏度可達到4拷貝/μl，結(jié)果表明建立的wnv數(shù)字pcr方法具有高效、特異、靈敏等特點，可用于西尼羅病毒的試驗檢測。

13、本發(fā)明摸索出一套成熟的wnv數(shù)字pcr操作方法，并在低拷貝病毒樣品的確認上具有一定優(yōu)勢，對wnv的高效防控和口岸動物疫病檢測具有十分重要的意義。

技術(shù)特征：

1.檢測西尼羅病毒的引物組和探針，其特征在于，引物序列如下：

2.檢測西尼羅病毒的試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的引物組和探針。

3.權(quán)利要求2所述的試劑盒在檢測西尼羅病毒方面的應用。

4.一種西尼羅病毒的數(shù)字pcr檢測方法，其特征在于，檢測方法的體系及程序如下：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的西尼羅病毒的數(shù)字pcr檢測方法，其特征在于，檢測方法用的退火溫度為60℃。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種西尼羅病毒數(shù)字PCR檢測方法，屬于分子生物學檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以WNV保守區(qū)域NS2A序列為模板，設(shè)計引物探針，建立了一種重復性好、靈敏度高、特異性好的西尼羅病毒(West?Nile?Virus，WNV)檢測方法，檢測結(jié)果顯示本方法特異性較好，對弓形蟲病(TOX)、布魯氏菌(BRF)、禽流感病毒(AIV)、H3N8馬流感病毒、尼帕病毒(NiV)、馬流感病毒(EHV)、馬動脈炎病毒(EAV)等家禽、家畜疾病無交叉反應，對WNV病毒的檢測靈敏度可達到4拷貝/μL，結(jié)果表明建立的WNV數(shù)字PCR方法具有高效、特異、靈敏等特點，可用于西尼羅病毒的試驗檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：劉小卓,王群,馬萍萍,姜帆,趙旭,常凱
受保護的技術(shù)使用者：青島海關(guān)技術(shù)中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6