本發(fā)明涉及生物，具體而言，涉及檢測鑒定苜蓿籽象的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

1、紫花苜蓿(medicago?sativa?l.)具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、飼用價值高(粗蛋白含量21％)、適口性好、用途廣泛等特點，被世界譽為“牧草之王”。作為一種高價值作物的同時，由于根系發(fā)達，具有減少土壤侵蝕的能力，也可用于恢復牧場。因此紫花苜蓿具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值。

2、隨著種植面積的增加，紫花苜蓿蟲害也日益嚴重，導致世界范圍內(nèi)的紫花苜蓿產(chǎn)量顯著下降。這些害蟲包括有紫花苜蓿籽象、苜蓿象甲、苜蓿蚜蟲、苜蓿斜紋夜蛾、苜蓿薊馬、苜蓿黏蟲、苜蓿潛葉蠅、苜蓿黃條跳甲等。它們通過取食植株的葉片、莖部和根部，直接導致紫花苜蓿的生長受阻和產(chǎn)量下降。此外，害蟲的取食不僅減少了植物的光合作用，還可能導致植株的營養(yǎng)品質(zhì)下降。害蟲的存在還增加了植物感染病害的風險。例如，某些害蟲是病原體的傳播者，會將病毒等病原體傳播給健康植株，從而引發(fā)更大范圍的損害。此外，害蟲的繁殖與發(fā)育往往會造成生態(tài)失衡，影響生物多樣性，并可能導致新害蟲種群的入侵。

3、苜蓿籽象(tychius?medicaginis?bris.)屬鞘翅目，象生科，其形態(tài)如圖1所示。苜蓿籽象幼蟲會蛀食種子，成蟲則啃食葉肉，危害花蕾，花萼和花冠，并取食花器的內(nèi)部結(jié)莢時，雌蟲產(chǎn)卵于幼嫩的豆莢內(nèi)，幼蟲孵化后，蛀入種子內(nèi)，并已排出的黑色糞便，填充豆莢，嚴重危害苜蓿產(chǎn)量和種子品質(zhì)。受害嚴重的苜蓿田，種子產(chǎn)量可能下降50％以上，這不僅減少了農(nóng)民的收入，還增大了對飼料行業(yè)的影響。隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，每年相關(guān)口岸都進口多批次苜蓿干草及苜蓿種子，該害蟲一旦傳入，危害非常嚴重，而檢疫是防止該害蟲定植、傳播最經(jīng)濟、最有效的方法。準確、快速、有效的檢測方法是實現(xiàn)有效檢疫的技術(shù)基礎(chǔ)，但是目前暫未出現(xiàn)針對苜蓿籽象的準確、快速、有效的檢測方法。

4、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種檢測紫花苜蓿籽象的試劑盒及其檢測方法，利用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法能夠快速、高效和準確地檢測出苜蓿籽象。

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測苜蓿籽象的pcr引物對，其中，該pcr引物對的正向引物的序列如seq?id?no.1所示，反向引物的序列如seq?id?no.2所示。

3、第二方面，本發(fā)明提供了上述pcr引物對在制備檢測苜蓿籽象的試劑盒中的應用。

4、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測苜蓿籽象的試劑盒，其包括上述pcr引物對。

5、第四方面，本發(fā)明提供了上述試劑盒在檢測苜蓿籽象中的應用。

6、第五方面，本發(fā)明提供了一種檢測苜蓿種子中是否含苜蓿籽象的方法，其包括：

7、提取苜蓿種子基因組dna，然后以提取到的dna為模板，利用上述試劑盒進行pcr擴增，再將pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；若電泳結(jié)果出現(xiàn)條帶則該苜蓿種子中含有苜蓿籽象；若不出現(xiàn)條帶則該苜蓿種子中不含有苜蓿籽象。

8、本發(fā)明具有以下有益效果：

9、(1)本發(fā)明的pcr檢測引物對特異性、靈敏度高，能夠從紫花苜蓿草種子快速準確地鑒定出是否含有苜蓿籽象，能夠?qū)④俎Ｗ严笈c其他常見害蟲比如苜蓿象甲、苜蓿蚜蟲、苜蓿斜紋夜蛾、苜蓿薊馬和苜蓿黏蟲等進行區(qū)分；

10、(2)以本發(fā)明的pcr引物組合檢測苜蓿籽象能夠同時進行大批量紫花苜蓿草種子的檢測，而且操作簡便，在實驗室條件下較短時間內(nèi)就能夠完成檢測；

11、(3)本發(fā)明提供的檢測方法適用于多種苜蓿品種，應用范圍廣泛，同時，本發(fā)明的檢測方法有助于紫花苜蓿種子檢驗人員對紫花苜蓿種子中是否混有苜蓿籽象進行檢驗，能夠減少人工和時間成本，具有良好的應用前景。

技術(shù)特征：

1.一種檢測苜蓿籽象的pcr引物對，其特征在于，所述pcr引物對的正向引物的序列如seq?id?no.1所示，反向引物的序列如seq?id?no.2所示。

2.如權(quán)利要求1所述的pcr引物對在制備檢測苜蓿籽象的試劑盒中的應用。

3.一種用于檢測苜蓿籽象的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的pcr引物對。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括pcr擴增試劑、dna模板和ddh2o。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述pcr擴增試劑包括taq?dna聚合酶、dntps、mgcl2和反應緩沖液。

6.如權(quán)利要求3-5任一項所述的試劑盒在檢測苜蓿籽象中的應用。

7.根據(jù)權(quán)利要6所述的應用，其特征在于，所述應用包括鑒定紫花苜蓿種子中是否含有苜蓿籽象。

8.一種檢測苜蓿種子中是否含苜蓿籽象的方法，其特征在于，包括：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，pcr擴增的反應體系為：pcr擴增試劑12.5μl，正向引物1.0μl，反向引物1.0μl，模板dna?0.5μl，ddh2o?10μl；

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，pcr擴增的反應程序為：95℃預變性3min，95℃變性15s，54℃退火15s，72℃延伸10s，循環(huán)35次，72℃延伸5min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種檢測紫花苜蓿籽象的試劑盒及其檢測方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的PCR檢測引物對特異性、靈敏度高，能夠從紫花苜蓿草種子快速準確地鑒定出是否含有苜蓿籽象，并將苜蓿籽象與其他常見害蟲比如苜蓿象甲、苜蓿蚜蟲、苜蓿斜紋夜蛾、苜蓿薊馬和苜蓿黏蟲等進行區(qū)分。以本發(fā)明的PCR引物組合能夠同時進行大批量紫花苜蓿草種子的檢測，而且操作簡便，在實驗室條件下較短時間內(nèi)就能夠完成檢測；另外，該檢測方法適用于多種苜蓿品種，應用范圍廣泛，并且有助于紫花苜蓿種子檢驗人員對紫花苜蓿種子中是否混有苜蓿籽象進行檢驗，能夠減少人工和時間成本，具有良好的應用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：劉志鵬,董書偉,羅棟,王召明,閆龍鳳,劉文獻,龍小健,楊皓元
受保護的技術(shù)使用者：蘭州大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2