本發(fā)明涉及生物醫(yī)學，尤其涉及一種shank3基因敲除小鼠模型及其構建方法和應用。

背景技術：

1、shank3基因編碼一種突觸后支架蛋白，主要存在于神經元的突觸后密度區(qū)(postsynaptic?density,psd)，在突觸的形成、成熟和維持中起重要作用。shank3基因的突變或缺失與多種神經發(fā)育障礙，如asd、精神分裂癥和智力障礙等密切相關。shank3基因的缺失或突變被認為是asd的重要致病因素之一。小鼠模型可以為asd的基本生物學機制提供獨特的見解，但現(xiàn)有的相關模型開發(fā)具有一定缺陷。

2、現(xiàn)有技術中已經公開了多種亞型特異性shank3小鼠模型，然而多個基因內啟動子和可變剪接的外顯子負責形成許多亞型，現(xiàn)有的shank3基因敲除模型多為部分外顯子敲除，大多數(shù)只破壞了一些亞型，可能存在shank3蛋白的殘留表達，相比之下，在患者中發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)已知shank3突變涉及破壞所有亞型的缺失，影響對基因功能和疾病機制的全面理解。由于基因內的多個基因內啟動子和可變剪接的編碼外顯子，點突變通常會導致shank3亞型特異性表達的有限破壞。然而在asd中發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)shank3突變是整個基因的缺失，大多數(shù)攜帶22q13.3缺失或phelan-mcdermid綜合征(pms)中整個shank3基因缺失的患者被診斷為asd。

3、現(xiàn)有技術1公開了一種采用傳統(tǒng)基因敲除技術，利用同源重組在shank3基因中引入突變，導致基因部分失活(半合子)的基因敲除策略(bozdagi?o,et?al.,haploinsufficiency?of?the?autism-associated?shank3?gene?leads?to?deficits?insynaptic?function,social?interaction,and?social?communication.molautism.2010；1(1):15)，但是其主要是基于半合子缺失模型，僅是部分失活，這與人類孤獨癥譜系障礙(asd)患者的基因缺陷程度不完全一致，可能無法完全模擬人類疾病的表型。此外，該模型只模擬了一種基因缺陷類型，未能涵蓋shank3基因其他類型的突變或缺失所導致的行為和功能變化。

4、現(xiàn)有技術2公開了一種改進的小鼠模型，該模型完全敲除了shank3基因，以模擬phelan-mcdermid綜合征(pms)的一些行為表型(drapeau?e,etal.,behavioralphenotyping?of?an?improved?mouse?model?of?phelan-mcdermid?syndrome?with?acomplete?deletion?of?the?shank3?gene.eneuro.2018may-jun；5(3):eneuro.0046-18.201)。但是仍是外顯子4-22的缺失，不完全反映人類pms患者的多樣性情況。這些患者的基因缺失程度和影響可能有較大變異性，因此該模型可能無法涵蓋所有可能的臨床表型。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種shank3基因敲除小鼠模型及其構建方法和應用，能夠實現(xiàn)shank3整個基因的完整敲除，所構建的模型具有更優(yōu)的應用前景。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

3、本發(fā)明提供了一種靶向敲除小鼠shank3基因的sgrna，包括sgrna-1和sgrna-2；

4、所述sgrna-1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

5、所述sgrna-2的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

6、本發(fā)明還提供了一種靶向敲除小鼠shank3基因的crispr/cas9系統(tǒng)，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括上述sgrna。

7、本發(fā)明還提供了一種靶向敲除小鼠shank3基因的試劑盒，所述試劑盒包括上述crispr/cas9系統(tǒng)。

8、本發(fā)明還提供了所述crispr/cas9系統(tǒng)或所述試劑盒在制備敲除小鼠shank3基因的細胞株中的應用。

9、本發(fā)明還提供了所述crispr/cas9系統(tǒng)或所述試劑盒在制備敲除小鼠shank3基因小鼠模型中的應用。

10、本發(fā)明還提供了一種shank3基因敲除小鼠模型的構建方法，包括以下步驟：

11、將所述靶向敲除小鼠shank3基因的crispr/cas9系統(tǒng)轉染至小鼠受精卵中，經過陽性篩選得到shank3基因敲除小鼠的受精卵，得到shank3基因敲除小鼠模型。

12、優(yōu)選的，還包括以下步驟：

13、將所述shank3基因敲除小鼠的受精卵培養(yǎng)得到f0小鼠；

14、將f0小鼠與野生型小鼠雜交，通過擴繁傳代得到純合小鼠和雜合小鼠；

15、所述f0小鼠、純合小鼠或雜合小鼠作為shank3基因敲除小鼠模型進行應用。

16、本發(fā)明還提供了通過所述構建方法得到的shank3基因敲除小鼠模型。

17、本發(fā)明還提供了所述shank3基因敲除小鼠模型在作為孤獨癥譜系障礙、精神分裂癥或智力障礙研究材料中的應用。

18、本發(fā)明還提供了一種雙sgrna位點靶向敲除小鼠shank3基因的鑒定方法，包括以下步驟：

19、提取待測細胞基因組dna；

20、以所述基因組dna為模板，用擴增引物對進行pcr擴增，所得pcr擴增產物進行檢測；

21、如與野生型相比，基因敲除后基因組片段長度缺失76kb，則實現(xiàn)雙sgrna位點靶向敲除小鼠shank3基因；

22、在所述擴增引物對中，上游引物的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；下游引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

23、所述雙sgrna位點包括sgrna-1和sgrna-2；

24、所述sgrna-1的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

25、所述sgrna-2的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

26、本發(fā)明的有益效果：

27、本發(fā)明提供的crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)能夠實現(xiàn)shank3整個基因的完整敲除，能夠用于構建shank3基因完整敲除的模型。

28、本發(fā)明提供的shank3?ko小鼠模型中，由于shank3整個基因的完整敲除，純合子已無shank3蛋白表達，雜合子表達量也較wt型降低，在shank3基因的功能開發(fā)或相關疾病的研究方面具有重要意義。

29、將本發(fā)明提供的shank3基因敲除小鼠模型用于孤獨癥譜系障礙研究中，其可涵蓋純合子、雜合子等多種表型，與人類孤獨癥譜系障礙(asd)患者的基因缺陷程度相似度更高，能夠更恰當?shù)挠糜谀M人類疾病可能的臨床表型，具有更廣泛的應用前景。

技術特征：

1.一種靶向敲除小鼠shank3基因的sgrna，其特征在于，包括sgrna-1和sgrna-2；

2.一種靶向敲除小鼠shank3基因的crispr/cas9系統(tǒng)，其特征在于，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括權利要求1所述sgrna。

3.一種靶向敲除小鼠shank3基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求2所述crispr/cas9系統(tǒng)。

4.權利要求2所述crispr/cas9系統(tǒng)或權利要求3所述試劑盒在制備敲除小鼠shank3基因的細胞株中的應用。

5.權利要求2所述crispr/cas9系統(tǒng)或權利要求3所述試劑盒在制備敲除小鼠shank3基因小鼠模型中的應用。

6.一種shank3基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.根據(jù)權利要求6所述的shank3基因敲除小鼠模型的構建方法，其特征在于，還包括以下步驟：

8.通過權利要求6或7所述的構建方法得到的shank3基因敲除小鼠模型。

9.權利要求8所述的shank3基因敲除小鼠模型在作為孤獨癥譜系障礙、精神分裂癥或智力障礙研究材料中的應用。

10.一種雙sgrna位點靶向敲除小鼠shank3基因的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術總結
本發(fā)明提供了一種Shank3基因敲除小鼠模型及其構建方法和應用，屬于生物醫(yī)學技術領域。本發(fā)明提供的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)能夠實現(xiàn)Shank3整個基因的完整敲除，能夠用于構建Shank3基因完整敲除的模型。本發(fā)明提供的小鼠模型中，由于Shank3整個基因的完整敲除，純合子已無Shank3蛋白表達，雜合子表達量也較WT型降低，在Shank3基因的功能開發(fā)或相關疾病的研究方面具有重要意義。將本發(fā)明提供的小鼠模型用于孤獨癥譜系障礙研究中，其與人類孤獨癥譜系障礙(ASD)患者的SHANK3基因缺陷程度相似度更高，能夠更恰當?shù)挠糜谀M人類疾病可能的臨床表型，具有更廣泛的應用前景。

技術研發(fā)人員：徐秀,劉春雪
受保護的技術使用者：復旦大學附屬兒科醫(yī)院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2