本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)分析，具體涉及一種特異性結(jié)合抗癌藥物伊馬替尼的核酸適配體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、伊馬替尼（ima）是一種小分子蛋白酪氨酸酶抑制劑，目前是一種靶向藥物，用于治療慢性粒細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病以及晚期胃腸道間質(zhì)間質(zhì)腫瘤。伊馬替尼及其鹽類（ima-s），如甲磺酸伊馬替尼或鹽酸伊馬替尼，是一種片劑或膠囊類的口服藥物，可阻斷多種蛋白激酶，用于治療慢性髓性白血病或者是惡性胃腸道間質(zhì)腫瘤患者；目前的ima-s臨床標(biāo)準(zhǔn)劑量為400-600?mg/d，但一些臨床試驗(yàn)表明，ima-s≤1000?ng/ml（1.7?μm）的血藥濃度存在藥物暴露不足的風(fēng)險(xiǎn)，可導(dǎo)致患者治療延遲和抑制疾病進(jìn)展；如果增加使用幾年，當(dāng)血液濃度中ima-s≥3180?ng/ml（5.4?μm）時(shí)又可能會(huì)增加藥物毒性風(fēng)險(xiǎn)，增加患者發(fā)生血液不良事件的幾率，因此合理控制患者血液藥物ima-s暴露濃度至關(guān)重要。此外，由于患者個(gè)體差異較大，患者對(duì)ima-s的耐受性差異較大，檢測(cè)患者的血藥濃度并為患者提供合適的藥物濃度窗口對(duì)于實(shí)現(xiàn)臨床個(gè)體化、精準(zhǔn)化治療具有重要意義。

2、現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)ima-s血液濃度的方法通常包括液相色譜-質(zhì)譜法（lc-ms）、高效液相色譜法（hplc）、氣相色譜-質(zhì)譜法（gc-ms）。但這些方法都存在一定的使用局限性，如樣品預(yù)處理復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、儀器成本高、對(duì)檢測(cè)人員的要求高等。近年來(lái)，研究人員也陸續(xù)開發(fā)了一些其他替代檢測(cè)方法，如基于材料基表面的增強(qiáng)拉曼散射（sers）傳感平臺(tái)和電化學(xué)傳感器等，但這些傳感器的材料制備步驟繁瑣，穩(wěn)定性和選擇性差。因此，開發(fā)一種便宜操作、選擇性靈敏穩(wěn)定的新型的檢測(cè)方法是當(dāng)下面臨的一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

3、在生物傳感器領(lǐng)域，目標(biāo)識(shí)別元素的選擇至關(guān)重要。抗體和核酸適配體作為生物傳感器不可或缺的分子識(shí)別元件，具有特異性好、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。與核酸適配體相比，抗體有許多局限性，如生產(chǎn)成本高、批次間變異大、易受溫度影響和不可逆性。相比之下，核酸適配體具有較高穩(wěn)定性、不易受環(huán)境干擾、保存時(shí)間長(zhǎng)、易于修飾等特點(diǎn)；進(jìn)一步地，核酸適配體作為一種單鏈寡核苷酸，可以與各種靶點(diǎn)結(jié)合，如小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等，適配應(yīng)用領(lǐng)域更廣。鑒于核酸適配體的上述優(yōu)勢(shì)，已被研究人員大量應(yīng)用于生物分析和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的，并已成為抗體的優(yōu)良替代品。同時(shí)，將核酸適配體和電化學(xué)結(jié)合在一起的電化學(xué)適配體（e-ab）傳感器，不僅具有核酸適配體的優(yōu)點(diǎn)，還具有電化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，如分析時(shí)間短，無(wú)需昂貴而復(fù)雜的儀器，操作方便。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種特異性結(jié)合伊馬替尼的核酸適配體及其篩選和應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種特異性結(jié)合伊馬替尼的核酸適配體，所述核酸適配體為apt-51、apt-37、apt-35、apt-33、apt-27中的一種；

4、所述apt-51的核苷酸序列為：ctatgtgaggctcgatcgttcggtgtgtttttaaagggtacagatcctggg；

5、所述apt-37的核苷酸序列為：atccacgctctttttctcgcattgagggtgacatagg；

6、所述apt-35的核苷酸序列為：tccacgctctttttctcgcattgagggtgacatag；

7、所述apt-33的核苷酸序列為：ccacgctctt?tttctcgcattgagggtgacata；

8、所述apt-27的核苷酸序列為：ctttttctccccccgcggggggcattg。

9、上述的核酸適配體的篩選方法，包括如下步驟：

10、（1）裁短設(shè)計(jì)：對(duì)apt-100進(jìn)行二維結(jié)構(gòu)裁短設(shè)計(jì)，破壞原雙鏈莖結(jié)構(gòu)，使其自由能增加；所述apt-100的核苷酸序列為atccacgctctttttctccccccgctatgtgaggctcgatcgttcggtgtgtttttaaagggtacagatcctgggcggggggcattgagggtgacatagg；

11、（2）分子對(duì)接模擬：通過(guò)分子對(duì)接模擬計(jì)算從步驟（1）中篩選出與伊馬替尼結(jié)合能小于核酸適配體apt-100的核苷酸序列，所述核苷酸序列為核酸適配體apt-51、apt-37、apt-35、apt-33、apt-27中任意一種；

12、（3）圓二色譜測(cè)試：將步驟（2）所得核酸適配體與伊馬替尼及其鹽類結(jié)合，采用圓二色譜測(cè)試篩選出結(jié)合前后，在280?nm處正特征峰存在最大變化值的核酸適配體；所述核酸適配體包括所述apt-37的核苷酸序列。

13、上述核酸適配體在檢測(cè)伊馬替尼及其鹽類中的應(yīng)用。

14、一種電化學(xué)核酸適配體傳感器，所述電化學(xué)核酸適配體傳感器包括核酸適配體apt-37。

15、進(jìn)一步地，所述核酸適配體的3′端修飾有二硫鍵，5′端修飾有亞甲基藍(lán)。

16、上述的電化學(xué)核酸適配體傳感器的制備方法，，包括如下步驟：

17、（1）納米多孔金電極的制備：將1.5?m?zncl2苯甲醇溶液加熱至125?℃，構(gòu)建三電極系統(tǒng)，其中工作電極為金電極，參比電極為ag/agcl，對(duì)電極為鉑絲，并放入苯甲醇溶液中，進(jìn)行cv掃描；然后將所得金電極放入丙酮，乙醇，去離子水依次進(jìn)行超聲波清洗，再浸入0.5?m?hcl溶液中進(jìn)行脫合金處理，最后對(duì)金電極進(jìn)行電化學(xué)清洗和活化，得到納米多孔金電極。

18、（2）電化學(xué)核酸適配體傳感器的組裝：將被硫醇化修飾的核酸適配體組裝在納米多孔金電極的表面，加入阻斷劑占據(jù)多余位點(diǎn)后沖洗干凈保存在磷酸鹽緩沖溶液中。

19、進(jìn)一步地，步驟（2）中所述阻斷劑為6-巰基-1-己醇、2-巰基乙醇、鹽酸半胱胺、二乙基二硫代氨基甲酸鈉、牛血清白蛋白中的任意一種。

20、一種上述的核酸適配體、上述的電化學(xué)核酸適配體傳感器在檢測(cè)伊馬替尼及其鹽類的應(yīng)用。

21、上述應(yīng)用具體包括如下步驟：

22、（1）基礎(chǔ)樣品測(cè)試：將電化學(xué)核酸適配體傳感器作為工作電極與參比電極ag/agcl、對(duì)電極鉑絲一同放置于待測(cè)生物樣品溶液中，分別測(cè)試在低頻和高頻條件下不含伊馬替尼及其鹽類時(shí)的方波伏安電流信號(hào)iblank；

23、（2）濃度-響應(yīng)曲線建立：向步驟（1）所述待測(cè)生物樣品溶液中加入不同濃度的伊馬替尼及其鹽類，分別測(cè)試在低頻和高頻條件下測(cè)試含有伊馬替尼及其鹽類不同濃度下的生物樣品溶液的方波伏安電流信號(hào)itarget，通過(guò)計(jì)算增益信號(hào)s?=(itarget–iblank)/iblank×100?%；或通過(guò)動(dòng)力學(xué)差分kdm?signal?(d)?=?s高頻–s低頻，計(jì)算出不同濃度下的kdm?signal（d）；根據(jù)所述信號(hào)增益s或所述kdm（d）與濃度的關(guān)系建立所述電化學(xué)核酸適配體傳感器的濃度-響應(yīng)曲線；

24、（3）標(biāo)定參數(shù)確定：對(duì)步驟（2）中得到的所述濃度-響應(yīng)曲線，用希爾方程進(jìn)行擬合，確定所述電化學(xué)核酸適配體傳感器的標(biāo)定參數(shù)k1/2，ystart,?yend,?n；所述希爾方程為：

25、

26、其中，y為s或d；

27、（4）未知樣品濃度測(cè)試：將步驟（3）得到的所述標(biāo)定參數(shù)k1/2，ystart,?yend，n再次代入希爾方程中，即可對(duì)未知樣品濃度定量檢測(cè)。

28、10.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述低頻條件為5?hz，所述高頻條件為100?hz。

29、本發(fā)明的有益效果為：

30、（1）本發(fā)明通過(guò)對(duì)apt-100進(jìn)行二維結(jié)構(gòu)裁短設(shè)計(jì)，篩選與ima的結(jié)合能低于apt-100的核酸適配體apt-51、apt-37、apt-35、apt-33和apt-27，其中apt-37具有高親和力和構(gòu)象較大的優(yōu)點(diǎn)，使用該核酸適配體制備得到的電化學(xué)適配體傳感器具有較好的選擇性和較低的靈敏度，檢測(cè)范圍0.1?μm-1000?μm，檢測(cè)限為0.1?μm，滿足臨床檢測(cè)ima的有效血藥濃度窄范圍窗口（1-5?μm）。

31、（2）與基于大型儀器的檢測(cè)技術(shù)相比，該傳感器制備方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，可以直接檢測(cè)血液中的ima，并快速得出結(jié)果，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，這為臨床監(jiān)測(cè)不同患者的ima血藥濃度提供了方法。