本發(fā)明涉及病毒檢測，具體涉及一種檢測ehv-1、ehv-4病毒的引物、探針及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、馬鼻肺炎（equine?rhinopneuminitis，er）是由馬皰疹病病毒1型（ehv-1）和馬皰疹病病毒4型（ehv-4）引起的馬屬動物間高度接觸性傳染病的總稱，屬三類疫病。該病感染引發(fā)原發(fā)性呼吸道疾病，嚴重還可引起孕馬流產(chǎn)、癱瘓、初生駒死亡及致死性馬皰疹病毒性腦炎（equineherpesvirus?myeloencephalopathy，ehm）等神經(jīng)癥狀，患馬通過鼻腔分泌物、糞便、流產(chǎn)胎兒等向外排毒，使病原在馬群內(nèi)廣泛傳播，該病不僅威脅馬匹健康，同時對養(yǎng)馬業(yè)、賽馬業(yè)以及附屬娛樂性馬產(chǎn)業(yè)等產(chǎn)業(yè)鏈帶來嚴重危害。

2、目前，該病尚無有效的治療藥物，也無免疫效果理想的疫苗，早期篩查是預防馬鼻肺炎的關(guān)鍵。篩查方法有病毒分離、免疫熒光、pcr方法等，但存在操作復雜、耗時較長、依賴儀器、對試驗條件要求較為嚴苛、易污染等弊端，因此，建立一種快速準確的臨床檢測方法，對臨床篩查、監(jiān)測和流行病學調(diào)查意義重大。

3、交叉引物等溫擴增（cpa）技術(shù)能夠在恒定溫度下實現(xiàn)核酸體外擴增，且價格低廉、操作簡便快速，靈敏度及特異性均較高，目前已應用于各領(lǐng)域病原菌的檢測，適用于ehv-1和ehv-4高發(fā)但資源受限的地方。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有ehv-1和ehv-4的檢測方法不能滿足對疾病早期篩查、早期預防的需求，更難以做到對混合感染病例早期篩查?；诖耍景l(fā)明旨在提供一種檢測ehv-1、ehv-4病毒的引物、探針及試劑盒，實現(xiàn)快速準確檢測ehv-1、ehv-4的目標。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種用于交叉引物擴增檢測ehv-1、ehv-4病毒的cpa-ehv-1/4引物、探針，所述引物、探針包括一條交叉引物、一對探針引物、一對外引物，所述交叉引物的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，所述探針引物的核苷酸序列如seq?id?no:2~3所示，所述外引物的核苷酸序列如seq?id?no:4~5所示。

4、所述用于交叉引物擴增檢測ehv-1和ehv-4的cpa-ehv-1/4引物，所述ehv-1/4選擇如seq?id?no:1~5所示的引物作為最終篩選的引物。

5、本發(fā)明還提供了一種用于交叉引物擴增檢測ehv-1、ehv-4病毒的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物、探針，所述引物、探針的核苷酸序列如seq?id?no:1~5所示。

6、進一步地，所述試劑盒還包括基礎緩沖溶液、dntps、mg2+、betaine、無核酸酶水、 bstdna聚合酶。

7、所述試劑盒包括如下組分：

8、cpa-ehv-1/4：10x bstreaction?buffer：2.5?μl、dntps（10mm）：2.5μl、mg2+（100mm）：1.5?μl、betaine（0.5?m）：2.5?μl、無核酸酶水：7.5?μl、 bstdna聚合酶：1.0?μl；交叉引物1s-2a（10μm）：2.5?μl、上游外引物4a（10μm）：0.5?μl、下游外引物5s（10μm）：0.5?μl、探針引物（fitc）3s（10μm）：1.5?μl、探針引物（biotin）1s（10μm）：1.5?μl、模板：1.0?μl。

9、一種基于cpa技術(shù)檢測ehv-1、ehv-4的方法，步驟包括：將上述引物組合與待測樣品混合，配制cpa反應體系，并在63℃下擴增反應40?min；取擴增產(chǎn)物5.0?μl，加入到45?μl的ddh2o進行稀釋后滴加到側(cè)流層析試紙條的樣品墊末端，反應5?min即可讀取結(jié)果。

10、所述的側(cè)流層析試紙條結(jié)合墊上有抗fitc的鼠源單抗，質(zhì)控線上有山羊抗鼠抗體，biotin（生物素）檢測線上標記有鏈霉親和素，fitc鼠源單抗用作標記膠體金。

11、cpa-ehv-1/4結(jié)果的判斷如下：

12、（1）t檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)條帶時，表明檢測樣品中含有馬皰疹病毒1型（ehv-1），或馬皰疹病毒4型（ehv-4），或馬皰疹病毒1型及4型混合感染；

13、（2）質(zhì)控線出現(xiàn)條帶檢測線未顯示條帶時，表明結(jié)果為陰性，即樣品中不含馬皰疹病毒1型，或馬皰疹病毒4型，或馬皰疹病毒1型及4型混合感染，或馬皰疹病毒的含量低于cpa-ehv-1/4法的檢出限；

14、（3）檢測線、質(zhì)控線均未出現(xiàn)條帶，則表明檢測結(jié)果無效。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

16、（1）本發(fā)明提供的用于交叉引物擴增檢測ehv-1、ehv-4的引物、探針及試劑盒、試紙條具有高度穩(wěn)定性、特異性和敏感性，cpa-ehv-1/4試紙條的靈敏度達到1.44×103拷貝·μl-1和1.02×103拷貝·μl-1倍；

17、（2）本發(fā)明提供的用于交叉引物擴增檢測ehv-1、ehv-4的引物、探針及試劑盒、試紙條具有快速、特異、靈敏、可視化、簡便的優(yōu)點。且對儀器依賴性較低，適用于基層或現(xiàn)場進行馬皰疹病毒1型、馬皰疹病毒4型感染的即時可視化檢測，可作為養(yǎng)殖場、基層實驗室等場所開展檢測的良好方法。

18、綜上，本發(fā)明建立的ehv-1/4?cpa-strip檢測技術(shù)無需復雜儀器、操作簡便、可進行現(xiàn)地檢測，為ehv-1和ehv-4的檢測提供了便利。

技術(shù)特征：

1.一種檢測ehv-1、ehv-4病毒的引物、探針，其特征在于：所述引物、探針包括一條交叉引物、一對探針引物、一對外引物，所述交叉引物的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，所述探針引物的核苷酸序列如seq?id?no:2~3所示，所述外引物的核苷酸序列如seq?id?no:4~5所示。

2.一種檢測ehv-1、ehv-4病毒的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的引物、探針，所述引物、探針的核苷酸序列如seq?id?no:1~5所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測ehv-1、ehv-4病毒的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括基礎緩沖溶液、dntps、mg2+、betaine、無核酸酶水、bst?dna聚合酶。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種檢測EHV?1、EHV?4病毒的引物、探針及試劑盒，涉及病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，所述引物、探針包括一條交叉引物、一對探針引物、一對外引物，所述交叉引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，所述探針引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2~3所示，所述外引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4~5所示。本發(fā)明建立的EHV?1/4?CPA?strip檢測技術(shù)無需復雜儀器、操作簡便、可進行現(xiàn)地檢測，為EHV?1和EHV?4的檢測提供了便利。

技術(shù)研發(fā)人員：王世民,肖楚寧,鄒聰
受保護的技術(shù)使用者：新疆農(nóng)業(yè)大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2