本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種甲狀腺癌相關基因突變的檢測方法及其應用。

背景技術：

1、甲狀腺癌(thyroid?cancer)是起源于甲狀腺濾泡上皮或濾泡旁上皮細胞的惡性腫瘤，是頭頸部最為常見的惡性腫瘤。甲狀腺癌的類型包括甲狀腺乳頭狀癌(ptc)、甲狀腺濾泡癌(ftc)、甲狀腺髓樣癌(mtc)以及甲狀腺未分化癌(atc)，其中最常見的是ptc，占所有甲狀腺癌的85％-90％。疾病發(fā)病率在全球逐年升高，高風險人群包括女性及那些有甲狀腺癌基因突變或家族史的人群。

2、癌癥的術前診斷和復發(fā)預測有助于及時確定手術方案和降低治療成本。液體活檢或穿刺活檢因其具有微創(chuàng)性便于在整個疾病過程中輕松獲得樣本成為腫瘤采樣的主流方式。活檢樣本中含有的腫瘤特異性的突變蘊含著重要的疾病線索，是腫瘤診斷和伴隨治療的有效指標。如braf?v600e突變可作為甲狀腺癌穿刺結(jié)節(jié)良惡性的指標，對其進行精準檢測可輔助進行甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性判斷。但因活檢樣本中基因組dna含量低、突變豐度低的特點對突變檢測工具提出了超靈敏和高特異的性能要求。

3、核酸探針因嚴格的堿基互補配對原則對靶標的識別具有較好的特異性。然而目前現(xiàn)有的核酸探針要么因過于穩(wěn)定，對單堿基的突變極其不敏感，或者為了增強核酸探針識別突變的敏感度，減弱其與突變靶標之間的結(jié)合，提高突變檢測的特異性的同時犧牲檢測突變的靈敏度。因此，需要發(fā)展一種新的甲狀腺癌相關基因檢測方法，可以檢測低豐度基因突變并且能夠同時在寬濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)高的靈敏度和高特異性，從根本上傳統(tǒng)雜交探針在檢測甲狀腺癌相關基因時靈敏度和特異性相互制衡的問題。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術問題，本技術提供了一種甲狀腺癌相關基因突變檢測方法，該方法使用三條甲狀腺癌相關基因突變檢測的核酸探針，可實現(xiàn)高靈敏度、高特異性且經(jīng)濟的優(yōu)點，能夠在寬的濃度范圍內(nèi)很好地實現(xiàn)低豐度的臨床樣品中突變的檢測，具有更好的推廣意義。

2、本發(fā)明的第一方面，提供了一種甲狀腺癌相關基因突變檢測的探針組，所述的探針組包括三條探針，所述的探針的序列包括seq?id?no：3-4任一所示的核苷酸序列或與seqid?no：3-4任一所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。

3、優(yōu)選的，所述的第一探針和第二探針組合為雙鏈探針組，第三探針與第一或第二探針包含相同的核苷酸序列。

4、優(yōu)選的，所述的第一探針包括seq?id?no：3所示的核苷酸序列；所述的第二、三探針包括seq?id?no：4所示的核苷酸序列。

5、優(yōu)選的，所述的探針還包含修飾，所述的第一探針的末端各包含一個熒光基團修飾，第二探針的末端各包含一個熒光猝滅基團修飾，第三探針的5’端或3’端包含一個熒光猝滅基團修飾。

6、優(yōu)選的，所述的熒光基團包括但不限于alex-350、fam、vic、tet、cal?gold540、joe、hex、cal?orange560、tamra、cal?red590、rox、cal?red610、texas?red、cal?red635、quasar670、cy3、cy5、cy5.5和/或quasar705。

7、優(yōu)選的，所述的熒光猝滅基團包括但不限于dabcyl、bhq類淬滅劑、eclipse和/或tamra。

8、優(yōu)選的，所述bhq類淬滅劑包括bhq-1和/或bhq-2。

9、優(yōu)選的，所述的第一探針末端兩個熒光基團相同或不同，進一步優(yōu)選的，所述的第一探針兩個末端包括不同的熒光基團。

10、優(yōu)選的，所述的第二探針末端兩個熒光猝滅基團相同或不同，進一步優(yōu)選的，所述的第二探針兩個末端包括不同的熒光猝滅基團。

11、優(yōu)選的，所述的第三探針的熒光猝滅基團與第二探針的熒光猝滅基團不同或與其中一個末端的熒光猝滅基團相同，進一步優(yōu)選的，所述的第三探針的熒光猝滅基團與第二探針其中一個末端的熒光猝滅基團相同。

12、優(yōu)選的，所述突變包括單核苷酸突變。

13、優(yōu)選的，所述單核苷酸突變是同一物種的不同個體間的同一基因座位上的核酸序列中的一個或多個相同或不同位置的單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失，且所述基因組的一個或多個核酸區(qū)段相同或不同。

14、優(yōu)選的，所述的探針的堿基序列可以包含特殊修飾。這些特殊修飾的堿基可以幫助調(diào)節(jié)探針的結(jié)合能力，例如增強探針結(jié)合能力或者削弱結(jié)合能力。比如能夠增強探針結(jié)合能力的特殊修飾堿基如鎖定核酸(即locked?nucleic?acids，縮寫為lna)堿基或肽核酸(pna)等。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的探針可由未經(jīng)修飾的堿基組成。在一個優(yōu)選實施方案中，對探針的堿基進行修飾。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的探針包含能增強或減弱探針結(jié)合能力的堿基。

15、本發(fā)明的第二方面，提供了一種甲狀腺癌相關基因突變的檢測產(chǎn)品，所述的檢測產(chǎn)品包含上述的探針組。

16、優(yōu)選的，所述的檢測產(chǎn)品還可以包括其他方法如pcr法、lcr法、tas法、ican法、lamp法、nasba法、rca法、tama法和/或ucan法中所需用到的引物或試劑。

17、在一個具體實施方式中，所述的檢測方法還包括進行pcr使用的相關試劑，所述的試劑包括pcr引物及組裝探針。

18、優(yōu)選的，所述的pcr引物包括seq?id?no：7-8。

19、優(yōu)選的，所述的組裝探針包括包括seq?id?no：7-11。

20、優(yōu)選的，所述的檢測產(chǎn)品包括但不限于試劑盒、試劑或芯片。

21、本發(fā)明的第三方面，提供一種基因突變的檢測方法，所述的檢測方法包括使用上述的檢測產(chǎn)品或上述探針組。

22、優(yōu)選的，所述的檢測方法包括：

23、(1)將第一探針和第二探針混合，加入待測靶序列，檢測熒光強度；

24、(2)加入第三探針，檢測熒光強度。

25、優(yōu)選的，所述的檢測方法包括將第一探針和第二探針及待測靶序列混合后獲得中間體，進一步加入第三探針后獲得催化產(chǎn)物，所述的中間體為第一探針與待測靶序列的組合物，所述的催化產(chǎn)物為第一探針與第三探針的組合物，分別檢測中間體和催化產(chǎn)物的熒光強度。

26、優(yōu)選的，所述的檢測方法通過檢測熒光強度判斷是否存在突變，突變靶序列與不存在野生型靶序列的情況相比，中間體和催化產(chǎn)物熒光或熒光強度增加，當存在野生型靶核酸序列的情況時，無熒光或熒光強度弱，不產(chǎn)生熒光響應。

27、優(yōu)選的，所述的檢測方法不用于疾病診斷或治療。

28、本發(fā)明的第四方面，提供上述的探針組或上述的檢測產(chǎn)品在制備甲狀腺癌檢測產(chǎn)品中的應用。

29、本發(fā)明術語“包括”或“包含”是開放式的描述，含有所描述的指定成分或步驟，以及不會實質(zhì)上影響的其他指定成分或步驟。

30、本發(fā)明所述的“同源性”或“同一性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本領域技術人員可以根據(jù)實際工作需要對序列進行調(diào)整，使使用序列與現(xiàn)有技術獲得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性/同一性。

31、本發(fā)明的有益效果：

32、本發(fā)明公開了一種新型的基于甲狀腺癌相關基因突變特異性的中間體和催化產(chǎn)物的催化突變識別方法。該探針包含三條核酸探針，實現(xiàn)了低至0.1％的單堿基突變檢測。本專利發(fā)明的新型探針設計簡單，無需修飾功能性核酸，使dna突變檢測對臨床和科研人員更加經(jīng)濟。此外，結(jié)合本專利發(fā)明的新型探針和pcr擴增技術，最后成功將其應用于檢測25對甲狀腺癌術后組織樣品和67例石蠟切片樣本(術后和穿刺)中的braf?v600e突變。

33、本方法克服了傳統(tǒng)探針單重識別突變機制，解決了傳統(tǒng)核酸雜交探針靈敏度和特異性相互制衡的問題。與現(xiàn)有的應用于臨床的甲狀腺癌相關基因突變檢測技術相比，本技術在寬的靶標濃度范圍內(nèi)可實現(xiàn)高靈敏度、高特異性且經(jīng)濟的優(yōu)點，能夠在寬的濃度范圍內(nèi)很好地實現(xiàn)低豐度的臨床樣品(如穿刺樣本)中突變的檢測，具有更好的推廣意義。