本技術(shù)涉及中華鱉性別鑒別的，具體涉及鑒別中華鱉性別的引物、試劑盒、試紙條、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、中華鱉(pelodiscus?sinensis)是鱉科、鱉屬爬行動物。中華鱉身體扁平，呈橢圓形；背和腹有龜甲，四肢為柔軟的革質(zhì)皮膚，沒有角質(zhì)鱗片；頭部粗大，前端略呈三角形；吻端延長呈管狀，有較長的肉質(zhì)吻突，大約和眼睛大小一樣；口中無齒，脖頸細(xì)長，伸縮自如，視覺敏銳；腹甲灰白色或黃白色，平坦光滑；尾部較短，四肢扁平，后肢比前肢發(fā)達(dá)，四肢均可縮入甲殼內(nèi)；背甲暗綠色或黃褐色，周邊為肥厚的結(jié)締組織，俗稱“裙邊”。

2、為實(shí)現(xiàn)中華鱉單性養(yǎng)殖與性控育種，首先需要確定中華鱉的性別決定類型。脊椎動物中存在2種性別決定類型，分別為環(huán)境性別決定(esd)和基因型性別決定(gsd)。在esd類型中，動物的性別受各種環(huán)境因素的影響，例如：鱷魚在低溫和高溫孵化產(chǎn)生雌性，而在中等溫度孵化則雄性占優(yōu)勢；錦龜和巨型側(cè)頸龜在低溫孵化產(chǎn)生雄性，而高溫孵化產(chǎn)生雌性。gsd類型分為xx/xy性染色體和zz/zw性染色體兩種不同的異配系統(tǒng)。中華鱉屬于zz/zw類型。中華鱉養(yǎng)殖周期長，生態(tài)養(yǎng)殖模式下需要1冬齡才可能通過外觀進(jìn)行性別鑒別。因此，開發(fā)出中華鱉早期性別分子鑒定技術(shù)，準(zhǔn)確鑒別初孵稚鱉性別，有助于實(shí)現(xiàn)稚鱉期單性分塘養(yǎng)殖，降低成本、提高效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)發(fā)明人根據(jù)中華鱉保守序列(zhbraa2)設(shè)計引物及試劑盒，能夠?qū)χ腥A鱉的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并根據(jù)pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物鑒別中華鱉性別，鑒別區(qū)分效率高，通用性強(qiáng)。另外，本技術(shù)發(fā)明人還將構(gòu)建了側(cè)向流層析試紙條。該試紙條能夠?qū)ψ鳛闃悠返臄U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行層析檢測，通過試紙條上的t線和c線進(jìn)行可視化、快速鑒別中華鱉性別。

2、第一方面，實(shí)施例公開了引物組，包括如seq?id?no:1和2所示的dna分子。

3、第二方面，實(shí)施例公開了引物組，所述引物組包括第一標(biāo)記的如seq?id?no:1所示的dna分子，以及第二標(biāo)記的如seq?id?no:2所示的dna分子；其中，所述第一標(biāo)記和所述第二標(biāo)記均選自生物素、異硫氰酸熒光素或地高辛中的一種，所述第一標(biāo)記與所述第二標(biāo)記不同。

4、第三方面，實(shí)施例公開了試劑盒。所述試劑盒包括第一方面所述的引物組及pcr擴(kuò)增試劑。

5、一些實(shí)施例中，所述pcr試劑包括：dntp混合物、10×ex?taqbuffer(mg2+free)、mgcl2(25mm)及takara?ex?taq(5u/μl)。

6、一些實(shí)施例中，所述pcr試劑為重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增試劑。所述重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增試劑為江蘇奇天基因生物科技有限公司，中國)。

7、第四方面，實(shí)施例公開了鑒別中華鱉性別的方法，包括提取待測中華鱉個體的基因組dna；采用如seq?id?no:1和2所示的dna分子對其進(jìn)行pcr擴(kuò)增；對該pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)該電泳檢測的條帶確定所述待測中華鱉個體的性別。

8、在該方法一些實(shí)施例中，該pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系以50μl計包括：1μl、50ng/μl的基因組dna，2μl、20μmol/μl的如seq?id?no:1所示的dna分子，2μl、20μmol/μl的如seq?id?no:2所示的dna分子，5μl?10×ex?taq?buffer(mg2+free)，3.3μl?mgcl2(25mm)，4μl?dntp混合物(atp、gtp、ctp及ttp的濃度均為2.5mmol/μl)，0.25μl?takaraex?taq(5u/μl)以及余量的雙蒸水。

9、在該方法一些實(shí)施例中，該pcr擴(kuò)增的反應(yīng)步驟包括：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃100s，35個循環(huán)；72℃5min。

10、在該方法一些實(shí)施例中，該pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系以50μl計包括：1μl、50ng/μl的基因組dna，1μl、10μmol/μl的如seq?id?no:1所示的dna分子，1μl、10μmol/μl的如seq?id?no:2所示的dna分子，2.5μl乙酸鎂，25μlraa反應(yīng)緩沖液，以及余量的雙蒸水。

11、在該方法的一些實(shí)施例中，該pcr擴(kuò)增的反應(yīng)步驟包括：39℃條件下反應(yīng)30min。

12、在該方法的一些實(shí)施例中，若無電泳條帶，則待測中華鱉個體為雄性個體。若出現(xiàn)213bp的目的條帶，則待測中華鱉個體為雌性個體。

13、第五方面，實(shí)施例公開了試劑盒。所述試劑盒包括第三方面所述的試劑盒、樣品稀釋液和試紙條。所述試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成。結(jié)合墊上包被膠體金顆粒標(biāo)記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測線和包被羊抗鼠抗體的控制線。第二方面所述的試劑盒中，所述上游引物標(biāo)記生物素，所述下游引物標(biāo)記地高辛。

14、一些實(shí)施例中，所述結(jié)合墊上包被膠體金顆粒粒徑為25nm，1ml膠體金顆粒標(biāo)記8.4μg鼠抗地高辛抗體，形成的膠體金-抗體復(fù)合物在結(jié)合點(diǎn)墊上的包被量為2ml/30cm。

15、一些實(shí)施例中，所述硝酸纖維素膜上檢測線包被親和素濃度為0.5mg/ml，包被量為1μl/cm；控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為1mg/ml，包被量為1μl/cm。

16、利用生物素、地高辛進(jìn)行引物對中華鱉的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使得陽性擴(kuò)增產(chǎn)物帶有雙標(biāo)記。同時膠體金試紙條上金標(biāo)結(jié)合墊上包被鼠抗地高辛抗體，層析膜的檢測線上包被能夠與生物素進(jìn)行特異結(jié)合的親和素，質(zhì)控線上包被羊抗鼠抗體。在層析過程中陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的地高辛標(biāo)記與金標(biāo)結(jié)合墊上金標(biāo)復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，之后所帶的生物素標(biāo)記物與層析膜上檢測線上親和素結(jié)合，形成的“三明治”夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物被檢測線捕獲從而顯色，多余的金標(biāo)復(fù)合物繼續(xù)層析，達(dá)到控制線時與包被的羊抗鼠抗體結(jié)合，從而被控制線捕獲而顯色。陰性擴(kuò)增產(chǎn)物由于無雙標(biāo)記物的存在在層析過程中不能夠被檢測線捕獲從而不顯色。

17、第六方面，實(shí)施例公開了鑒別中華鱉性別的方法。該方法包括：從中華鱉組織中提取基因組dna；采用第二方面所述的引物組對所述基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；將所述pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物加樣至試紙條的樣品墊上；根據(jù)所述試紙條的檢測線的顯示和控制線的顯示鑒別中華鱉性別。

18、在該方法的一些實(shí)施例中，若所述檢測線和所述控制線均顯色，則所述中華鱉為雌性。若所述檢測線不顯色，而所述控制線顯色，則所述中華鱉為雄性。

19、第七方面，實(shí)施例公開了第一方面的引物組、第二或三方面的試劑盒，以及第四或五方面所述的方法在鑒別中華鱉性別的用途。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)的有益效果至少包括：

21、利用實(shí)施例提供的引物對中華鱉的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，能夠直接根據(jù)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果鑒別中華鱉性別，鑒別過程簡便直接。

22、進(jìn)一步地，實(shí)施例還利用標(biāo)記的引物對中華鱉的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行側(cè)向流試紙條檢測，能夠?qū)⒔Y(jié)果直接簡便地可視化展示，鑒別結(jié)果簡單有效。

23、實(shí)施例提供的引物組、試劑盒及方法能夠?qū)cr擴(kuò)增技術(shù)和免疫層析技術(shù)相結(jié)合實(shí)現(xiàn)對核酸產(chǎn)物的快速檢測，pcr擴(kuò)增后，產(chǎn)物不需要通過復(fù)雜的凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，在3-10min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)中華鱉性別鑒定。

24、實(shí)施例提供的引物組、試劑盒及方法操作簡單，只需將核酸產(chǎn)物與一定量pbs混合后滴加在試紙條樣品孔即可，無需其他操作。

25、實(shí)施例提供的引物組、試劑盒及方法反應(yīng)速度快，在3-10min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)中華鱉性別鑒定，縮短了檢測時間。

26、實(shí)施例提供的引物組、試劑盒及方法成本低，檢測不需要復(fù)雜的儀器，普通pcr儀即可，也不需昂貴的特殊試劑，檢測成本低。

27、實(shí)施例提供的引物組、試劑盒及方法對操作者的要求低，由于該技術(shù)不需要復(fù)雜的儀器，操作過程簡單，檢測結(jié)果肉眼判讀，所以任何人經(jīng)過自學(xué)或者簡單的培訓(xùn)即可勝任。

28、實(shí)施例提供的引物組、試劑盒及方法的安全性高，不需要用到特殊試劑，避開凝膠電泳中eb等污染物，對操作者和試驗(yàn)環(huán)境都是安全無害的。