本發(fā)明屬于鑒定lncrna，具體涉及一種鑒定lncrna的方法。

背景技術(shù)：

1、長鏈非編碼?rna（lncrna）是一類長度超過?200nt，不能編碼蛋白或只能編碼短肽的?rna?分子，參與調(diào)控了多種生物學(xué)過程，以下是一種鑒定豬?lncrna?的方法：樣品采集：從豬的組織或細(xì)胞中提取總?rna；rna?測序：利用二代測序技術(shù)對總?rna?進(jìn)行測序，獲得大量的測序數(shù)據(jù)；數(shù)據(jù)預(yù)處理：對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾，去除低質(zhì)量的?reads?和接頭序列；轉(zhuǎn)錄本組裝：使用轉(zhuǎn)錄本組裝軟件，如?stringtie?或?cufflinks，將測序?reads組裝成轉(zhuǎn)錄本；lncrna?鑒定：根據(jù)?lncrna?的特征，如長度、編碼潛力和表達(dá)水平等，從組裝的轉(zhuǎn)錄本中鑒定出?lncrna；功能預(yù)測：對鑒定出的?lncrna?進(jìn)行功能預(yù)測，可通過與已知功能的基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，或利用生物信息學(xué)工具預(yù)測其可能的生物學(xué)功能；實驗驗證：選擇部分?lncrna?進(jìn)行實驗驗證，如通過?rt-pcr、northern?blot?或?rna?干擾等技術(shù)，驗證其在豬組織或細(xì)胞中的表達(dá)和功能。上述的操作步驟繁瑣并且耗時長，成本高，亟需一種簡單方便的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了提供一種簡單快捷準(zhǔn)確率高的鑒定豬lncrna的方法。

2、本發(fā)明提供1.一種鑒定lncrna的方法，所述方法的具體步驟如下：

3、步驟1?：選取待鑒定的長度大于200nt的非環(huán)狀rna的正向的開放閱讀框；

4、步驟2：將步驟1中獲得的正向的開放閱讀框的基因序列與編碼熒光蛋白的基因連接獲得重組序列，將重組序列與表達(dá)載體連接獲得重組載體；

5、步驟3：將步驟2中獲得的重組載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得rna序列；

6、步驟4：將步驟3獲得的rna注射到豬胚胎中，利用熒光顯微鏡檢測檢測熒光強(qiáng)度，若有熒光表達(dá)則此rna并非為lncrna，若沒有熒光表達(dá)則此rna為lncrna。

7、進(jìn)一步地限定，步驟1中正向的開放閱讀框的選擇方法：利用open?reading?framefinder工具，將待檢測rna的cdna的gi號、accession號或序列的fasta格式輸入openreading?frame?finder工具中，選擇minimal?orf?length為75，genetic?code?為standard，orf?start?codon?to?use為“atg”?only，submit后，選擇standard為+的所有的orf。

8、進(jìn)一步地限定，熒光蛋白為紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白、黃色熒光蛋白或綠色熒光蛋白。

9、進(jìn)一步地限定，熒光蛋白為egfp。

10、進(jìn)一步地限定，步驟1中rna?為的序列如seq?id?no.5或seq?id?no.3所示。

11、進(jìn)一步地限定，步驟2中的編碼熒光蛋白的基因序列如seq?id?no.1所示。

12、進(jìn)一步地限定，步驟2中重組載體的出發(fā)載體為peasy-t1載體?。

13、進(jìn)一步地限定，步驟3中的方法：給dna序列進(jìn)行加帽，然后去除dna序列，最后進(jìn)行加尾，純化后獲得rna序列。

14、進(jìn)一步地限定，步驟4中的豬胚胎為1-細(xì)胞階段的豬孤雌胚胎。

15、進(jìn)一步地限定，步驟4中是待胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞階段時觀察胚胎的熒光強(qiáng)度。

16、有益效果：本發(fā)明的方法相比于傳統(tǒng)的體外驗證rna是否是lncrna的方法，本發(fā)明為體內(nèi)的驗證實驗更加準(zhǔn)確，準(zhǔn)確率為100%，操作更加方便。

技術(shù)特征：

1.一種鑒定lncrna的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中正向開放閱讀框的選擇方法：利用open?reading?frame?finder工具，將待檢測rna的cdna的gi號、accession號或序列的fasta格式輸入open?reading?frame?finder工具中，選擇minimal?orf?length為75，genetic?code?為standard，orf?start?codon?to?use為“atg”?only，submit后，選擇standard為+的所有的orf。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，熒光蛋白為紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白、黃色熒光蛋白或綠色熒光蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，熒光蛋白為egfp。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中rna的序列如seq?id?no.5或seqid?no.3所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中的編碼熒光蛋白的基因序列為seqid?no.1所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2中重組載體的出發(fā)載體為peasy-t1載體?。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3中的方法：以dna序列為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得加帽的rna，然后去除dna序列，最后進(jìn)行加尾，純化后獲得rna序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4中的豬胚胎為1-細(xì)胞階段的豬孤雌胚胎。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4中是待胚胎發(fā)育到2-細(xì)胞階段時觀察胚胎的熒光強(qiáng)度。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種鑒定lncRNA的方法，屬于鑒定lncRNA技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明為了提供一種簡單快捷準(zhǔn)確率高的鑒定哺乳動物lncRNA的方法。本發(fā)明提供一種鑒定lncRNA的方法，選取待鑒定的長度大于200nt的非環(huán)狀RNA的正向的開放閱讀框；將獲得的開放閱讀框的基因序列與編碼熒光蛋白的基因連接獲得重組序列，將重組序列與表達(dá)載體連接獲得重組載體；將獲得的重組載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA序列；將獲得的RNA注射到豬胚胎中，利用熒光顯微鏡檢測檢測熒光強(qiáng)度，若有熒光表達(dá)則此RNA并非為lncRNA，若沒有熒光表達(dá)則此RNA為lncRNA。實現(xiàn)準(zhǔn)確快速篩選lncRNA。

技術(shù)研發(fā)人員：偉人悅,王加強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6