本發(fā)明屬于植物病理學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種侵染紫丁香的，水蠟a病毒(lva)可視化rt-lamp的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、紫丁香(syringa?oblata?lindl)是木樨科(oleaceae)丁香屬(syringa?linn)植物，是我國特有的觀賞花木之一，已有1000多年的栽培歷史。分布于吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北等地區(qū)。近年發(fā)現(xiàn)丁香上出現(xiàn)明顯的花葉癥狀，疑似病毒病。

2、本發(fā)明涉及的水蠟a病毒(lva)為乙型線性病毒科(betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(carlavirus)病毒，是一種線狀rna病毒，被侵染的植物其葉片呈現(xiàn)環(huán)狀褪綠斑點癥狀，在北京、沈陽、韓國等地區(qū)均有關(guān)于此病毒的報道。

3、目前，植物病毒檢測技術(shù)主要依賴于精密的儀器設(shè)備，反應(yīng)成本高、反應(yīng)條件復(fù)雜且耗時久等問題逐漸暴露出來。木本植物對病毒有極好的抑制作用，病毒含量往往相對較低，其癥狀不明顯。同時，難以檢測木本植物病毒，因為難以通過摩擦接種人工接種木本植物病毒。lamp檢測技術(shù)具有靈敏度高、操作簡便、反應(yīng)時間短、成本低等特點，僅需4條特異性引物，恒溫條件下，通過肉眼即可觀察檢測結(jié)果，很好的解決了上述問題，lamp技術(shù)在植物病毒檢測方法中越來越重要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種水蠟a病毒(lva)可視化rt-lamp檢測方法及試劑盒。本發(fā)明建立了一種快速檢測水蠟a病毒(lva)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法，以這種病毒的cp區(qū)域序列為模板，設(shè)計特異性引物進(jìn)行擴增，并通過體系中酸堿指示劑的顏色變化觀察檢測結(jié)果。

2、本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于水蠟a病毒可視化rt-lamp快速檢測的引物組、試劑盒及其應(yīng)用。

3、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

4、一種水蠟a病毒(lva)可視化rt-lamp檢測方法，以水蠟a病毒cp基因區(qū)域序列為靶基因設(shè)計特異性引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，通過擴增產(chǎn)物中的酸堿指示劑的顏色變化，肉眼直接觀察檢測結(jié)果。

5、進(jìn)一步，所述水蠟a病毒cp基因的核苷酸序列見序列1。

6、進(jìn)一步，所述的特異性引物包括fip-lva，bip-lva，f3-lva和b3-lva，序列如下：

7、fip-lva:gcgctacgttctccacgcaataacgttgtcgaaactcggc

8、bip-lva:aatgcctgtttggaaatcggcccagattcgatggatctccgc

9、f3-lva：aaggcaccaaccaatggc

10、b3-lva：tccgtagaaggtcggttgaa

11、其中，所述的fip-lva和bip-lva分別由f2-lva和f1c-lva，b2-lva和b1c-lva聚合進(jìn)行合成：

12、f2-lva：taacgttgtcgaaactcggc

13、f1c-lva：gcgctacgttctccacgcaa

14、b2-lva：cagattcgatggatctccgc

15、b1c-lva：aatgcctgtttggaaatcggcc

16、第二方面，所述的特異性引物組是以水蠟a病毒cp基因區(qū)域序列為靶基因設(shè)計的特異性引物，包括fip-lva，bip-lva，f3-lva和b3-lva：

17、fip-lva:gcgctacgttctccacgcaataacgttgtcgaaactcggc

18、bip-lva:aatgcctgtttggaaatcggcccagattcgatggatctccgc

19、f3-lva：aaggcaccaaccaatggc

20、b3-lva：tccgtagaaggtcggttgaa

21、本發(fā)明的具體實施方式中，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的25μl反應(yīng)體系為：bstⅱdnaploymerse?1μl，2.5x?ph?sensitive?lamp?reaction?mix10μl，fip/bip(10μm)4μl，f3/b3(10μm)1μl，rnase-free?water?1.5μl,n-red?stain1.5μl，植物cdna或重組質(zhì)粒樣本1μl。

22、一種水蠟a病毒可視化rt-lamp檢測方法，使用上述的引物組對待測樣品進(jìn)行rt-lamp擴增，利用電泳檢測或肉眼直接觀察檢測樣本中是否含有該種病毒，上述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物由以下步驟得到：

23、1、選取該病毒基因組中的cp基因序列為模板，通過在線網(wǎng)站primerexplorer?v5進(jìn)行引物設(shè)計，選擇其中綜合得分最高的一組引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；

24、2、利用reverse?transcriptase?m-mlv(rnase?h-)試劑盒(購自寶生物工程(大連)有限公司)合成cdna，反應(yīng)體系(全量10μl)如下：模板rna(1ng-1μg)，specific?primer006-c12vacpr8080(10μm)1μl、dntps(10mm)0.5μl，5x?reverse?transcriptase?m-mlvbuffer?2μl，rnase?inhibitor(40u/μl)0.25μl，reverse?transcriptase?m-mlv(rnaseh-)(200u/μl)0.25μl，rnase?free?h2o(up?to?10μl)。

25、3、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系(25μl)如下：bstⅱdnaploymerse?1μl,2.5x?phsensitive?lamp?reaction?mix10μl，fip/bip(10μm)4μl，f3/b3(10μm)1μl，rnase-freewater?1.5μl，n-red?stain1.5μl，植物cdna或重組質(zhì)粒樣本1μl；反應(yīng)條件：65℃30min；

26、4、根據(jù)n-red?stain酸堿指示劑的顏色變化判斷植物rna樣本中是否含有病毒以及產(chǎn)物擴增情況，黃色為陽性反應(yīng)，紅色為陰性反應(yīng)，實現(xiàn)病毒的肉眼可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴增；

27、5、將擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，通過電泳圖進(jìn)一步觀察產(chǎn)物擴增結(jié)果。

28、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

29、1、本發(fā)明提供的引物在tm值、dg、gc含量、引物間距離、二級結(jié)構(gòu)等方面都是最優(yōu)的lamp擴增引物，僅用4條特異性引物，65℃30min反應(yīng)條件下便可檢測到樣本中是否含有病毒，具有簡便、快速、靈敏、特異性高、檢測結(jié)果可視化等優(yōu)勢，反應(yīng)過程僅需半小時即可完成，且lamp擴增是在等溫條件下進(jìn)行的，只需一臺水浴鍋，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的分子試劑。

30、2、本發(fā)明通過指示劑顏色的變化直接觀察檢測結(jié)果，即紅色為陰性反應(yīng)，黃色為陽性反應(yīng)，可快速診斷出疑似病株是否攜帶病毒，且實驗證明檢測靈敏度比常規(guī)pcr高200倍，對于病毒的早期診斷更加精確。