本文描述了用于在使用工程化核酸酶引入雙鏈斷裂后提高同源定向修復(fù)（hdr）效率并減少同源不依賴性整合的組合物和方法。此外，對雙鏈dna供體進行修飾，以在使用可編程核酸酶引入雙鏈斷裂后提高供體效力和同源定向修復(fù)的效率。

背景技術(shù)：

1、使用可編程核酸酶的基因組編輯允許將dna位點特異性地引入到感興趣的靶基因組中。許多系統(tǒng)允許靶向基因組編輯，并且這些系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（talen）、鋅指（zfn）或成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（crispr）。

2、crispr-cas9系統(tǒng)已被廣泛用于在真核細胞中進行位點特異性基因組編輯。需要序列特異性指導rna將cas9蛋白召集到靶位點，然后cas9內(nèi)切核酸酶切割靶dna的兩條鏈，產(chǎn)生雙鏈斷裂（dsb）。這種dsb被細胞的先天dna損傷修復(fù)途徑校正。dsb修復(fù)的兩個主要途徑是易錯非同源末端連接（nhej）途徑，其可以導致靶dna中的隨機插入或缺失（插入缺失），以及同源定向修復(fù)（hdr）途徑，其使用與dsb的任一側(cè)具有同源性的單鏈或雙鏈dna分子作為修復(fù)模板，在靶dna中產(chǎn)生所需突變[1]。

3、可以使用各種不同形式的dna作為用于hdr實驗的修復(fù)模板，例如質(zhì)粒dna、雙鏈線性dna（dsdna）或單鏈dna（ssdna）。dsdna和ssdna供體兩者均可以在哺乳動物組織培養(yǎng)細胞中誘導先天性免疫應(yīng)答。對于短的插入（通?！?20?bp）或突變來說，化學合成的寡核苷酸例如idt??ultramer??ssdna，可以用作單鏈寡核苷酸供體（ssodn），以用于hdr實驗。合成ssdna的使用允許將化學修飾置于所述分子中，以潛在地提高hdr效率。由于合成的復(fù)雜度提高，用于較大插入（通常>120?bp）的模板受到限制。長ssdna的產(chǎn)生可能是勞動密集且高成本的過程，而線性dsdna可以快速且大量地產(chǎn)生。由于更加普遍的nhej修復(fù)途徑便于平末端的連接，因此線性dsdna供體具有同源不依賴性整合到細胞中存在的任何dsb（包括靶上cas9切割位點、任何cas9脫靶位點和任何內(nèi)源dsb）中的更高風險[2,?3]。當在靶上位點處發(fā)生同源不依賴性整合時，包括同源臂在內(nèi)的整個供體被并入，導致一個或兩個同源臂區(qū)的重復(fù)。

4、已報道，在線性dsdna供體上添加5′-生物素修飾可以減少串聯(lián)體的形成和通過nhej途徑的整合[4]。同樣，另一個研究組報道了5′-端上的生物素或ssdna突出部可以減少平端插入[5]。另一個研究組提出dsdna供體的5′-端上的teg和2′-ome核糖核苷酸接頭可以通過限制nhej機器接近所述供體的游離末端來潛在地提高hdr率，但是沒有證明平端整合的任何減少[6]。

5、需要用于hdr的修飾的dsdna模板的組合物及其方法，所述組合物和方法提高hdr的效率并減少通常與線性dsdna供體相伴的不想要的同源不依賴性整合（在靶位點和潛在的脫靶或內(nèi)源dsb兩者處）。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本文描述的一個實施方式是一種雙鏈dna同源定向修復(fù)（hdr）供體，其包含第一同源臂區(qū)、插入?yún)^(qū)和第二同源臂區(qū)，其中所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)包含對5'-端處或附近的一個或多個核苷酸的修飾。在一種情況下，所述修飾包括：對所述第一同源臂區(qū)的5′-端處或附近的一個或多個核苷酸的2′-位置的修飾，和對所述第二同源臂區(qū)的5′-端處或附近的一個或多個核苷酸的2′-位置的修飾。在另一種情況下，所述修飾包括對所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)的5′-端處或附近的5′-端核苷酸、5′-倒數(shù)第二個核苷酸、5′-倒數(shù)第三個（第三）核苷酸或所述核苷酸的組合的2′-位置的修飾。在另一種情況下，所述雙鏈dna?hdr供體的5′-端處或附近的修飾包括2′-o-甲基（2′-ome）、2′-氟（2′-f）或2′-o-甲氧基乙基（2′-moe）中的一者或多者。在另一種情況下，所述雙鏈dna?hdr供體的5′-端處或附近的修飾包括2′-moe。在另一種情況下，所述5′-端處或附近的修飾是相對于靶dna的非模板錯配。在另一種情況下，所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)的長度為40至150個核苷酸。在另一種情況下，所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)的長度為至少100個核苷酸。在另一種情況下，所述雙鏈dna?hdr供體還包含通用引物序列。在另一種情況下，所述插入?yún)^(qū)大于100?bp。在一種情況下，所述插入?yún)^(qū)大于0.25?kb、大于0.5?kb、大于1?kb、大于2kb、大于3?kb、大于4?kb、大于5?kb、大于6kb、大于7?kb、大于8?kb、大于9?kb或大于10?kb。在另一種情況下，所述雙鏈hdr供體在5′-端或3′-端中的任一者處包含發(fā)夾。在另一種情況下，所述雙鏈hdr供體在5′-端和3′-端兩者處包含發(fā)夾。在另一種情況下，所述雙鏈dna?hdr供體在可編程核酸酶系統(tǒng)中提高同源定向修復(fù)效率并減少同源不依賴性整合。

2、本文描述的另一個實施方式是一種可編程核酸酶系統(tǒng)，其包含修飾的雙鏈dna同源定向修復(fù)（hdr）供體、可編程核酸酶和grna，其中所述grna分子能夠?qū)⑺隹删幊毯怂崦阜肿影邢虻桨泻怂?。在一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體包含第一同源臂區(qū)、插入?yún)^(qū)和第二同源臂區(qū)；其中所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)包含對5'-端處或附近的一個或多個核苷酸的修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體包含對所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)的5′-端處或附近的5′-端核苷酸、5′-倒數(shù)第二個核苷酸、5′-倒數(shù)第三個（第三）核苷酸或所述核苷酸的組合的2′-位置的修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體在5′-端處或附近包含一個或多個核苷酸的至少一個2′-ome、2′-f或2′-moe修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體在5′-端處或附近包含一個或多個2′-moe修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體包含通用引物序列。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體在可編程核酸酶系統(tǒng)中提高同源定向修復(fù)效率并減少同源不依賴性整合。在另一種情況下，所述可編程核酸酶系統(tǒng)包含轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（talen）、鋅指（zfn）或成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（crispr）中的一者或多者。在另一種情況下，所述可編程核酸酶系統(tǒng)是crispr。在另一種情況下，所述可編程核酸酶是crispr相關(guān)-9（cas9）。在另一種情況下，所述可編程核酸酶系統(tǒng)還包含一種或多種hdr增強劑。

3、本文描述的另一個實施方式是一種在可編程核酸酶系統(tǒng)中提高同源定向修復(fù)（hdr）率并減少同源不依賴性整合的方法，所述方法包括使用活性可編程核酸酶系統(tǒng)和修飾的雙鏈dna?hdr供體靶向候選編輯靶位點基因座。在一種情況下，所述修飾的雙鏈dnahdr供體包含第一同源臂區(qū)、插入?yún)^(qū)和第二同源臂區(qū)；其中所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)包含對5'-端處或附近的一個或多個核苷酸的修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體包含對所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)的5′-端處或附近的5′-端核苷酸、5′-倒數(shù)第二個核苷酸、5′-倒數(shù)第三個（第三）核苷酸或所述核苷酸的組合的2′-位置的修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體在5′-端處或附近包含一個或多個核苷酸的至少一個2′-ome、2′-f或2′-moe修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體在5′-端處或附近包含一個或多個2′-moe修飾。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dnahdr供體包含通用引物序列。在另一種情況下，所述方法還包含一種或多種hdr增強劑。在另一種情況下，所述修飾的雙鏈dna?hdr供體在可編程核酸酶系統(tǒng)中提高同源定向修復(fù)效率并減少同源不依賴性整合。

4、本文描述的另一個實施方式是修飾的雙鏈dna?hdr供體用于在可編程核酸酶系統(tǒng)中提高同源定向修復(fù)（hdr）率并減少同源不依賴性整合的用途，其中所述修飾的雙鏈dnahdr供體包含第一同源臂區(qū)、插入?yún)^(qū)、第二同源臂區(qū)和任選的一個或多個通用引物序列；其中所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)包含對5'-端處或附近的一個或多個核苷酸的修飾。在一種情況下，所述修飾包括在所述雙鏈dna?hdr供體的5′-端處或附近的一個或多個核苷酸的至少一個2′-ome、2′-f或2′-moe修飾。

5、本文描述的另一個實施方式是一種制造修飾的雙鏈dna?hdr供體的方法，所述方法包括合成包含第一同源臂區(qū)、插入?yún)^(qū)、第二同源臂區(qū)和任選的一個或多個通用引物序列的寡核苷酸；其中所述第一同源臂區(qū)和所述第二同源臂區(qū)包含對5'-端處或附近的一個或多個核苷酸的修飾。在一種情況下，所述修飾包括在所述雙鏈dna?hdr供體的5′-端處或附近的一個或多個核苷酸的至少一個2′-ome、2′-f或2′-moe修飾。

6、本文描述的另一個實施方式是一種制造修飾的雙鏈dna?hdr供體的方法，所述方法包括使用一個或多個通用引物擴增包含第一同源臂區(qū)、插入?yún)^(qū)、第二同源臂區(qū)的靶核酸序列，其中所述通用引物序列包含對5'-端處或附近的一個或多個核苷酸的修飾。在一種情況下，所述修飾包括在所述通用引物的5′-端處或附近的一個或多個核苷酸處的至少一個2′-ome、2′-f或2′-moe修飾。