本發(fā)明專利涉及生物，尤其是指一種突觸囊泡-納米盤融合體系及其在藥物篩選中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域中，體外融合實驗是一種常用的模擬體內(nèi)突觸囊泡與突觸前膜融合的技術(shù)，因其提供了一個開放的平臺，方便研究者引入各種感興趣的調(diào)控突觸囊泡和突觸前膜融合的蛋白質(zhì)或藥物而被廣泛使用?，F(xiàn)在主流的體外融合實驗是基于兩種分別代表突觸囊泡和突觸前膜的脂質(zhì)體的融合來完成。

2、用于融合實驗的脂質(zhì)體(liposome)形態(tài)與突觸囊泡相似，通常是直徑在50nm左右的圓球，由磷脂和跨膜蛋白組成。磷脂和蛋白質(zhì)的種類按照其模擬的目標物有所不同，例如模擬突觸囊泡的脂質(zhì)體是由含有較高比例的酸性磷脂的磷脂混合物合成，而模擬突觸前膜的脂質(zhì)體中則含有較低比例的酸性磷脂。在蛋白方面，模擬突觸囊泡的脂質(zhì)體通常會帶有參與突觸囊泡與突觸前膜融合的核心蛋白vamp2，該蛋白也是突觸囊泡的標志性蛋白，而模擬突觸前膜的脂質(zhì)體則帶有參與融合的核心蛋白snap25和syntaxin-1a。這三個蛋白的親和力很高，結(jié)合在一起會形成一種可拉近突觸囊泡與突觸前膜距離、促進膜融合發(fā)生的融合機器——snare復(fù)合物，其中的vamp2因其存在于囊泡膜(vesicle?membrane)上，所以在該復(fù)合物中也稱v-snare，而snap25和syntaxin-1a這兩種蛋白因存在于突觸前膜(也稱靶膜target?membrane)，因此在該復(fù)合物中合稱t-snares。該復(fù)合物是參與融合的核心蛋白復(fù)合物，是研究融合過程的最小單位，也是許多蛋白質(zhì)和藥物的作用靶標。通過影響這個核心蛋白復(fù)合物的功能，可直接影響兩膜的融合過程，最終影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

3、現(xiàn)有的體外模擬神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中突觸囊泡與突觸前膜融合的研究主要是合成人工脂質(zhì)體方案，該方案是在體外合成兩種脂質(zhì)體，一種為v-脂質(zhì)體(v-liposome)，一種是t-脂質(zhì)體(t-liposome)。其中，v-脂質(zhì)體是指插入了vamp2這種蛋白質(zhì)(簡稱v-snare)的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體模擬的是突觸囊泡；另一種t-脂質(zhì)體指的是加入了蛋白質(zhì)t-snares(t-snares由snap25和syntaxin-1a以1:1的摩爾比構(gòu)成)，模擬了突觸前膜。其中，v-脂質(zhì)體的合成方式是將摩爾比為72％的popc、25％的dops、1.5％的nbd-dope和1.5％的rhodamine-dope在氯仿中混合，渦旋混勻并在氮氣下干燥磷脂15分鐘，然后真空干燥1-2小時，并用緩沖液(1mhepes、2mkcl、0.2mmtcep、10％的甘油和1.5％的og)重懸干燥的磷脂，然后以磷脂混合物：蛋白質(zhì)的摩爾比為100:1的比例加入v-sanre，充分混勻后過夜透析除掉其中的1.5％的og，第二天用密度梯度(由下到上分別為30％的optiprep、20％的optiprep、待純化的樣品)離心的方式(55000rpm，5.5h)將脂質(zhì)體純化出來，脂質(zhì)體最后可以在20％的optiprep那一層中找到一個明顯的白色脂質(zhì)體層，用長針吸取200微升即可獲取。相同的，t-脂質(zhì)體的制備與v-脂質(zhì)體的制備過程相似，只是在磷脂組成上變成摩爾比為85％的popc、15％dops，并且加入的蛋白質(zhì)變?yōu)閠-snares(snap25與syntaxin-1a的摩爾比1:1)。將兩種脂質(zhì)體制備出來之后即可使用，將v-脂質(zhì)體：t-脂質(zhì)體以體積比為1:9的比例混合，4℃避光孵育2個小時，加入到黑色96孔板中，放入酶標儀調(diào)整好動力學(xué)參數(shù)(酶標儀的激發(fā)光波長設(shè)置為460nm，檢測光波長設(shè)置為535nm)即可測量得到結(jié)果。融合原理如圖1所示，插入了v-snare的v-脂質(zhì)體，和插入了t-snares的t-脂質(zhì)體，會一起形成snare復(fù)合物，該復(fù)合物蛋白是神經(jīng)元內(nèi)介導(dǎo)突觸囊泡和突觸前膜融合的核心部件，在這里介導(dǎo)v-脂質(zhì)體和t-脂質(zhì)體的融合。該方案中檢測融合是使用nbd-rhob這對熒光染料，原理是：在一定距離范圍內(nèi)，合適波長的激發(fā)光(460nm)刺激會導(dǎo)致供體(nbd)產(chǎn)生發(fā)射光，該發(fā)射光又可成為受體(rhob)的激發(fā)光并被受體吸收，而超過這一距離，供體的發(fā)射光(535nm)因不能被受體所吸收而被我們檢測到。如圖1所示，兩種脂質(zhì)體一種攜帶這對熒光染料，一種不攜帶。當融合發(fā)生，供受體之間距離增加而無法完成能量轉(zhuǎn)移，從而使得我們檢測到的供體發(fā)射光(535nm)增強，從而呈現(xiàn)出圖5的右圖融合的曲線變化，橫坐標代表時間，縱坐標代表融合的百分比。該方案常用于在體外模擬突觸囊泡和突觸前膜的融合過程，并且在制作脂質(zhì)體或者在融合過程中加入感興趣的蛋白質(zhì)可以進行進一步的研究。然而，其存在明顯的不足，主要表現(xiàn)在：①曲率較高的球形脂質(zhì)體不能很客觀地模擬出體內(nèi)低曲率的突觸前膜，換句話說，兩個球體之間的接觸不能很好地模擬出一個球體與一個平面的接觸效果，并且很多研究表明曲率是影響突觸釋放的一個重要物理參數(shù)。②即使兩個脂質(zhì)體發(fā)生融合了，即熒光增加了，也無法直接說明神經(jīng)遞質(zhì)釋放了，而神經(jīng)遞質(zhì)釋放才是融合的最終目的。因為無論是體內(nèi)還是體外，都會出現(xiàn)kiss?and?run現(xiàn)象。換句話說，融合發(fā)生在極短的時間內(nèi)，完成了一部分的磷脂交流并讓nbd-rhob熒光染料間距離增加了，融合信號增強了，但是并沒有來得及釋放神經(jīng)遞質(zhì)，所以該方案只能研究融合，不能直觀反映神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。③只插入vamp2這一種蛋白并不夠，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用鼠腦來源的囊泡融合程度更高也更快。如果是在脂質(zhì)體上繼續(xù)插入融合所需蛋白質(zhì)的話，加大提蛋白的工作量的同時也可能會改變脂質(zhì)體原本的結(jié)構(gòu)及大小。而且模擬突觸囊泡的這種脂質(zhì)體里面并沒有神經(jīng)遞質(zhì)，需要提前將關(guān)注的神經(jīng)遞質(zhì)包進里面，所以直接使用從鼠腦中提取出來的突觸囊泡變成了最合適的選擇。

4、因此，提供一種更合適的體外模擬神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中突觸囊泡與突觸前膜融合的體系顯得很有必要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、納米盤(nanodisc)是一種人工合成的形似圓盤狀的膜結(jié)構(gòu)，相比于脂質(zhì)體，其曲率很低，可更真實地模擬突觸前膜的存在形態(tài)。納米盤也是由磷脂和蛋白質(zhì)組成，但與脂質(zhì)體不同的地方在于，為維持其圓盤結(jié)構(gòu)需要加入一種兩性的膜支架蛋白(如msp)，環(huán)繞在磷脂雙分子層外圍，用于橫向捆綁磷脂雙分子層，進而形成曲率極低的圓盤狀結(jié)構(gòu)，圓盤直徑通過調(diào)節(jié)膜支架蛋白和磷脂的摩爾配比決定。與脂質(zhì)體相似，納米盤也可以作為上述跨膜蛋白和膜相互作用蛋白的載體，例如t-snares，進而從形態(tài)和功能上模擬突觸前膜。

2、突觸囊泡是一類存在于動物神經(jīng)系統(tǒng)的小細胞器，用于存儲和釋放神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)即動物的大腦中分布最為密集。當興奮傳導(dǎo)至軸突末端的時候，電壓門控鈣通道打開，鈣離子內(nèi)流，突觸囊泡與突觸前膜融合，進而發(fā)生神經(jīng)遞質(zhì)的同步釋放。從實驗動物的大腦中分離純化出的突觸囊泡因其保留了所有的原始功能、包含了人工制備脂質(zhì)體難以具備的實現(xiàn)膜融合的所有蛋白質(zhì)，還包裹著各種神經(jīng)遞質(zhì)，所以可以作為研究融合和釋放的理想材料。

3、本發(fā)明涉及一種通過納米盤與突觸囊泡融合的方法，體外檢測目標蛋白或藥物對神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響?，F(xiàn)在主流的人工合成脂質(zhì)體體外融合實驗有許多不足之處，例如含有t-snares的高曲率脂質(zhì)體小泡無法模擬突觸前膜低曲率的平滑表面；含有v-snare的脂質(zhì)體小泡難以取代真正的突觸囊泡，因為從體內(nèi)提取的突觸囊泡是一種含有全部蛋白質(zhì)并包裹著神經(jīng)遞質(zhì)的小細胞器，并且其上有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的多種藥物響應(yīng)位點；脂質(zhì)體之間只能進行融合檢測，無法進行神經(jīng)遞質(zhì)釋放的檢測，因為即使將神經(jīng)遞質(zhì)提前包被進脂質(zhì)體中，兩個脂質(zhì)體融合之后仍為封閉的空間，無法將神經(jīng)遞質(zhì)釋放到外界溶液被我們所檢測到。所以針對上述的脂質(zhì)體體外融合實驗的不足之處，我們采用突觸囊泡與納米盤的融合，首先納米盤可以提供低曲率的平滑表面，能從形態(tài)上更好地模擬突觸前膜；其次使用鼠腦來源的突觸囊泡，可以極大程度地模擬生理條件下的融合和釋放情況；再次，用納米盤來釋放突觸囊泡中原有的神經(jīng)遞質(zhì)，可以打開突觸囊泡，將神經(jīng)遞質(zhì)直接檢測到外部溶液中，實現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)的直接檢測；最后，在納米盤的組成成分上，我們也對其進行了改良，加入了一種特殊的磷脂——磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(pip2)，該磷脂是多種突觸囊泡蛋白(例如鈣傳感器蛋白synaptotagmin-1)的效應(yīng)磷脂，可以在synaptotagmin-1與鈣離子結(jié)合之后協(xié)助其構(gòu)象發(fā)生變化，促進融合的發(fā)生。除此之外，該融合體系的開放性使其可以直接檢測不同蛋白或者藥物對突觸囊泡的融合以及突觸囊泡中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放的影響，由此我們可以開展目標蛋白研究、藥物篩選以及疾病治療等多種體外研究。

4、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一，由此，在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一種突觸囊泡-納米盤融合體系，包括突觸囊泡與納米盤，所述突觸囊泡與納米盤的體積比為7-9：1。

5、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述納米盤原料的摩爾比為55-65：0.5-1.5：1.5-2.5的磷脂混合物、msp和t-snares。

6、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述磷脂混合物的原料以摩爾比計，包括78-83％的popc、13-18％的dops、0.5-1.5％的pip2、1-2％的nbd-dope和1-2％的rhodamine-dope。

7、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述磷脂混合物的制備方法包括：將popc(1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿)、dops(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-l-絲氨酸(鈉鹽))、pip2(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇-4',5'-二磷酸)(銨鹽))、nbd-dope(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(7-硝基-2-1,3-苯并惡二唑-4-基))和rhodamine-dope(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(麗絲胺羅丹明b磺?；?)混勻、干燥、重懸，得到所述磷脂混合物。

8、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述納米盤的制備包括如下步驟：將所述磷脂混合物、msp和t-snares混合、靜置、孵育、搖晃、純化，得到所述納米盤。

9、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述純化包括：凝膠過濾柱孵分離。

10、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述突觸囊泡的制備方法包括：

11、步驟1)：將鼠腦浸泡于緩沖液(緩沖液組成為320mm蔗糖和4mm?hepes?ph＝7.4)中，并用勻漿儀勻漿鼠腦；

12、步驟2)：第一離心，將第一離心得到的上清液第二離心，低滲法破碎第二離心得到的突觸體沉淀，第三離心；

13、步驟3)：用optiprep密度梯度離心法對所述第三離心得到的上清液進行純化，選取突觸囊泡含量最高的一層，取出。

14、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述步驟2)中，第一離心的離心力為950-1050g，離心時間為8-12min；第二離心的離心力為14000-16000g，離心時間為12-18min；第三離心的離心力為16000-18000g，離心時間為20-30min。

15、在本發(fā)明的一個或多個實施例中，所述步驟3)中，離心管中自上到下optiprep離心液的質(zhì)量濃度依次為：0％、16％、23.5％、30％。

16、在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種在本發(fā)明第一方面所述的突觸囊泡-納米盤融合體系在藥物篩選中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的有益效果在于：

18、1、本發(fā)明提供了一種突觸囊泡-納米盤融合體系，構(gòu)建了一個接近生理情況的體外突觸囊泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的檢測體系，通過突觸囊泡與模擬突觸后膜的納米盤的融合過程，實現(xiàn)了對神經(jīng)遞質(zhì)釋放的直接檢測與定量分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，縮短了檢測時間，將檢測時間控制在5min以內(nèi)。

19、2、本發(fā)明提供一種在本發(fā)明第一方面所述的突觸囊泡-納米盤融合體系在藥物篩選中的應(yīng)用。

20、3、本發(fā)明提供了一種突觸囊泡-納米盤融合體系可以應(yīng)用于神經(jīng)活性物質(zhì)篩選和作用機制研究。利用所構(gòu)建的體外融合檢測體系，通過評估不同藥物分子或蛋白因子對突觸囊泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響，可以篩選和發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)活性物質(zhì)，并深入探討其作用機制，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物開發(fā)提供新的研究工具和思路。

21、4、本發(fā)明對神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)研究和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物開發(fā)具有重要的應(yīng)用價值。