本發(fā)明屬于植物基因工程，更具體地說，涉及一種根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法。

背景技術：

1、馬尾松(pinus?massoniana?lamb.)為松科松屬喬木，具有耐干旱瘠薄的特性，在我國南方多個省份廣泛分布，為主要的荒山造林樹種，具有重要的生態(tài)價值。同時，其用途廣泛，經濟價值極高，廣泛應用于建筑工程、燃料、藥用及工業(yè)原料等領域。

2、然而，由于馬尾松生長周期長，遺傳負荷大，傳統(tǒng)育種方法難以滿足快速遺傳改良的需求。面對這一挑戰(zhàn)，基因工程技術提供了新的解決方案。遺傳轉化技術，尤其是農桿菌介導法，因其高效率和可重復性，已成為針葉樹種遺傳改良的主要方法。

3、農桿菌介導的遺傳轉化效率主要受所使用的受體材料、農桿菌菌株種類及濃度、侵染時間與共培養(yǎng)時間等關鍵因素的影響。在受體材料的選擇上，胚性愈傷組織是研究植物遺傳轉化的理想材料之一，具有外源整合能力強、對抗生素極為敏感但對農桿菌耐受性佳、再生能力高效穩(wěn)定等特點，同時，愈傷組織的基因型對于轉化效率也有較大影響。鑒于松屬樹種的重要性，其遺傳轉化研究備受關注，近年來取得了較大進展，但與其他物種相比依然較為緩慢。迄今為止，119個松屬樹種中成功實現(xiàn)轉基因的依然極為有限。目前，有研究者使用胚性愈傷組織為受體材料，通過選用不同農桿菌菌株(lba4404、eha105或gv3101等)及合適的侵染濃度，成功培育出輻射松(p.radiata)、火炬松(p.taeda)、海岸松(p.pinaster)、展葉松(p.patula)的轉基因植株，成功構建了北美喬松(p.strobus)(doi.org/10.48130/forres-0024-0007)和油松(pinus?tabuliformis)的瞬時基因表達體系(doi:10.1186/s13007-020-00594-5)。因此，針對特定松屬樹種的遺傳轉化，選擇合適的受體材料、確定適合轉化的菌株及適宜的侵染濃度等尤為重要。作為我國重要鄉(xiāng)土樹種的馬尾松，其遺傳轉化研究進展亦相對緩慢，目前雖有研究人員以馬尾松成熟合子胚為受體材料，成功培育出轉基因植株(doi:10.1007/s11240-018-1388-7)，但其遺傳轉化體系的穩(wěn)定性和效率尚需提高。目前，缺乏以馬尾松胚性愈傷組織作為受體材料的遺傳轉化體系的相關報道。因此，建立一種高效穩(wěn)定的馬尾松遺傳轉化體系，對于加速馬尾松功能基因挖掘與研究、縮短馬尾松遺傳改良進程至關重要。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，具有遺傳轉化性能穩(wěn)定且陽性率高等優(yōu)勢。

2、為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案如下：

3、一種根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，采集馬尾松未成熟球果并誘導培養(yǎng)出胚性愈傷組織，以處于pemiii階段的馬尾松胚性愈傷組織為材料，進行懸浮預培養(yǎng)獲得受體材料，采用od600值為0.2-0.6的農桿菌侵染液進行侵染，侵染結束后經共培養(yǎng)、恢復培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)和成熟培養(yǎng)后，采用gus進行組織化學染色并進行分子鑒定，最終獲得轉基因胚性愈傷組織。

4、所述的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，所述農桿菌選自根癌農桿菌agl1、lba4404、eha105、gv3101。

5、所述的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，所述馬尾松胚性愈傷組織的基因型為1-3-5。

6、所述的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，所述馬尾松胚性愈傷組織的基因型為1-3-5，所述農桿菌為根癌農桿菌agl1。

7、所述的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，所述馬尾松胚性愈傷組織的基因型為1-3-5，所述農桿菌為lba4404或eha105或gv3101。

8、所述的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，所述馬尾松胚性愈傷組織的基因型為1-3-5，所述農桿菌為lba4404或eha105或agl1，侵染濃度od600值為0.6。

9、所述的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，所述馬尾松胚性愈傷組織的基因型為1-3-5，所述農桿菌為gv3101，侵染濃度od600值為0.2-0.6。

10、所述的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，具體步驟包括：

11、1)將基因型為1-3-5的馬尾松未成熟雌配子體消毒后接種至誘導培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織；

12、所述誘導培養(yǎng)基的配方為：lp基本培養(yǎng)基+2mg/l?2,4-d+1mg/l?6-ba+0.25mg/lvc+30g/l麥芽糖+1g/l肌醇+0.5g/l水解酪蛋白+0.45g/l谷氨酰胺，ph?5.8；

13、2)將穩(wěn)定增殖的胚性愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)；

14、所述增殖培養(yǎng)基的配方為：lp基本培養(yǎng)基+1mg/l?2,4-d+0.5mg/l?6-ba+0.25mg/lvc+30g/l麥芽糖+1g/l肌醇+0.5g/l水解酪蛋白+0.45g/l谷氨酰胺+6.24g/l瓊脂，ph?5.8；

15、3)將處于pemiii階段的馬尾松胚性愈傷組織轉移至液體懸浮培養(yǎng)液中進行懸浮預培養(yǎng)；

16、所述液體懸浮培養(yǎng)液配方為：lp基本培養(yǎng)基+0.5mg/l?2,4-d+0.25mg/l?6-ba+15g/l麥芽糖+1g/l肌醇+0.5g/l水解酪蛋白+0.45g/l谷氨酰胺+100μm乙酰丁香酮，ph?5.8；

17、4)將含有目的基因的質粒轉化agl1農桿菌后制備侵染液；

18、5)使用od600值為0.6的侵染液侵染預培養(yǎng)后的愈傷組織；

19、6)侵染結束后將愈傷組織轉移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)；

20、所述共培養(yǎng)基配方為：lp基本培養(yǎng)基+1mg/l?2,4-d+0.5mg/l?6-ba+0.25mg/l?vc+15g/l麥芽糖+1g/l肌醇+0.5g/l水解酪蛋白+0.45g/l谷氨酰胺+6.24g/l瓊脂+100μm乙酰丁香酮，ph?5.8；

21、7)將共培養(yǎng)后的愈傷組織脫菌后轉移至恢復培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)；

22、所述恢復培養(yǎng)基配方為：lp基本培養(yǎng)基+1mg/l?2,4-d+0.5mg/l?6-ba+0.25mg/lvc+15g/l麥芽糖+1g/l肌醇+0.5g/l水解酪蛋白+0.45g/l谷氨酰胺+6.24g/l瓊脂+300mg/l特美汀+300mg/l頭孢噻肟，ph?5.8；

23、8)將恢復培養(yǎng)后的愈傷組織轉移至篩選培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)，最終獲得遺傳轉化后的陽性胚性愈傷組織；

24、所述篩選培養(yǎng)基配方為：lp基本培養(yǎng)基+1mg/l?2,4-d+0.5mg/l?6-ba+0.25mg/lvc+15g/l麥芽糖+1g/l肌醇+0.5g/l水解酪蛋白+0.45g/l谷氨酰胺+6.24g/l瓊脂+300mg/l特美汀+300mg/l頭孢噻肟+25mg/l潮霉素，ph?5.8。

25、9)對篩選培養(yǎng)后的陽性轉化愈傷組織進行組織化學染色及分子鑒定，最終獲得轉基因胚性愈傷組織。

26、10)將轉基因的胚性愈傷組織轉移至成熟培養(yǎng)基中進行成熟處理，獲得轉基因的體細胞胚；

27、所述成熟培養(yǎng)基配方為：lp基本培養(yǎng)基+5mg/l?aba+0.5mg/lga3+0.25mg/l?vc+130g/l?peg8000+1.5g/l活性炭+20g/l麥芽糖+1g/l谷氨酰胺+1g/l肌醇+3.5g/l植物凝膠，ph?5.8。

28、相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為：

29、1)本技術的根癌農桿菌介導的馬尾松遺傳轉化體系的構建方法，將馬尾松未成熟雌配子體消毒后接種至誘導培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織；將獲得的胚性愈傷組織接種于增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)；將生長良好的處于pemiii階段的愈傷組織轉移至液體懸浮培養(yǎng)液中進行懸浮預培養(yǎng)；將含有目的基因的質粒轉化農桿菌后制備侵染液；使用侵染液侵染預培養(yǎng)后的愈傷組織；侵染結束后將愈傷組織轉移至共培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)；將共培養(yǎng)后的愈傷組織脫菌后轉移至恢復培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)；將恢復培養(yǎng)后的愈傷組織轉移至篩選培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)，最終獲得遺傳轉化后的陽性胚性愈傷組織。

30、2)本技術以馬尾松未成熟雌配子體為外植體進行胚性愈傷組織誘導，獲得能穩(wěn)定增殖的胚性愈傷組織，用于進行后續(xù)馬尾松遺傳轉化體系構建的實驗材料。在侵染后共培養(yǎng)6d后，能夠成功脫菌且愈傷組織正常生長。

31、3)本技術的實施例證實：采用根癌農桿菌菌株agl1、gv3101、lba4404、eha105進行侵染轉化，均能都成功獲得了陽性轉化愈傷組織，且陽性率不低于93％，高達100％，說明該體系穩(wěn)定且效率較高，為后續(xù)馬尾松的基因功能和品質改良研究提供基礎。

32、4)本技術的實施例證實：將轉基因胚性愈傷組織進行成熟培養(yǎng)后，成熟處理后的轉基因愈傷組織分化為體細胞胚。在成熟處理50d后，體細胞胚gus染色顯色為藍色。